朱天地 陳琛 王煒 陳子萱 李靜雯

摘要：選用3個(gè)青稞品種（系）0841-6、T09-401、昆侖3號(hào)為試驗(yàn)材料，采用改良苯酚品紅溶液對(duì)小孢子染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察小孢子發(fā)育情況，分析青稞小孢子發(fā)育時(shí)期與旗葉距（旗葉與倒二葉的葉耳間距離）之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，旗葉距為 0～3 cm 時(shí)，小孢子發(fā)育處于二分體時(shí)期;3～8 cm 時(shí)，大部分小孢子細(xì)胞處于四分體階段;8～13 cm 時(shí)，單核中期為主;13～18 cm時(shí)，花藥中存在各種發(fā)育時(shí)期的小孢子，但以單核靠邊期為主;當(dāng)旗葉距>18 cm 時(shí)，小孢子開(kāi)始大量成熟，直至發(fā)育為成熟花粉。供試青稞小孢子品種（系）的發(fā)育時(shí)期均與旗葉距有一定的相關(guān)性，旗葉距可作為青稞花藥和小孢子培養(yǎng)幼穗取材的重要形態(tài)學(xué)指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：青稞;旗葉距;小孢子;發(fā)育時(shí)期;花藥培養(yǎng);染色

中圖分類號(hào)：S512.3? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ?文章編號(hào)：1001-1463（2020）09-0036-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2020.09.010

Abstract：Three highland barley cultivars including 0841-6， T09-401 and Kunlun 3 were used as experiment materials，staining highland barley microspores with modified phenol magenta solution， the development of microspore was observed under optical microscope， and the relationship between the microspore developmental stage of highland barley and the flag leaf spacing was analyzed. The results showed that when the flag leaf spacing was 0～3 cm， the microspore development was basically in dyad; At 3～8 cm， the microspore development was basically in tetrad; At 8～13 cm，the microspores developed into mid-uninucleate; At 13～18 cm，various kinds of developmental stages of microspores could be observed，but most of them were late-uninucleate microspores; When the flag leaf spacing exceeded 18 cm， a big scale of microspores entered mature period and developed into mature pollens. The development stages of the three kinds of highland barley microspores all have a certain correlation with the flag leaf spacing， the flag leaf spacing can be used as a morphological indicator on sampling of young spikes in the highland barley anther and isolated microspore culture.

Key words：Highland barley;Flag leaf spacing;Microspore;Developmental stage;Anther culture; Staining

青稞（Hordeum vulgare L. var nudum Hook.f.）是我國(guó)的原產(chǎn)物種之一，為禾本科大麥屬的一種谷類作物[1 - 3 ]。因其內(nèi)外穎與穎果分離，籽粒裸露在外面，故而得名裸大麥、米大麥或元麥[4 ]，主要種植在青海、甘肅、西藏等高海拔地區(qū)，已有4 000多年種植歷史[5 ]。青稞根據(jù)其棱數(shù)的不同，分為二棱青稞、四棱青稞和六棱青稞;按其顏色，又可被分為紫青稞、花青稞、白青稞、黑青稞等[6 ]。青稞不同于其他谷類，具有“三高兩低” 的特點(diǎn)，即高纖維、高蛋白質(zhì)、高維生素、低脂和低糖等，有預(yù)防糖尿病、降低膽固醇等作用，是現(xiàn)代健康文明生活的理想保健食品[7 ]。隨著青稞營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不斷地被挖掘，人們對(duì)其關(guān)注日漸增多，青稞已廣泛涉及釀酒工業(yè)、功能食品、糧食工業(yè)、飲料工業(yè)等領(lǐng)域[8 ]。

青稞新品種的選育工作已經(jīng)開(kāi)展約70 a，且培育了大量的優(yōu)良品種，但傳統(tǒng)育種方法耗時(shí)耗力。由于長(zhǎng)期對(duì)產(chǎn)量、抗性和品質(zhì)的要求，很可能造成青稞遺傳多樣性的下降，對(duì)青稞新品種的選育不利[9 - 10 ]。單倍體育種在植物育種研究中具有重要應(yīng)用價(jià)值，花藥和小孢子培養(yǎng)是獲得單倍體的有效途徑，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體，快速獲得純合育種材料，大大縮短育種年限，提高選擇效率，加快育種進(jìn)程。小孢子發(fā)育階段與花藥離體培養(yǎng)效果的相關(guān)性，是花藥離體培養(yǎng)取材的關(guān)鍵，發(fā)育到一定階段的花粉對(duì)離體刺激最敏感，并最終發(fā)育成完整植株[11 ]。例如，紅花槐的花粉發(fā)育階段與花冠與花萼的長(zhǎng)度比、花蕾縱徑等有直接關(guān)系[12 ];在大麥花30中，小孢子發(fā)育時(shí)期與旗葉距存在相關(guān)性[13 ];水稻中，旗葉距為7～11 cm時(shí)為小孢子離體培養(yǎng)的最佳時(shí)期[14 ];在秈稻中，小孢子處于單核靠邊期時(shí)葉枕距為4～6 cm，為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)期[15 ]。為了解小孢子發(fā)育時(shí)期與旗葉距的相關(guān)性，幼穗的取材需要建立更為精細(xì)的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，以獲得更多處于適宜時(shí)期的花藥和小孢子進(jìn)行培養(yǎng)。我們以3個(gè)青稞品種（系）0841-6、T09-401和昆侖3號(hào)為試驗(yàn)材料，對(duì)其不同旗葉距的花藥染色壓片，用顯微鏡觀察計(jì)數(shù)并拍照統(tǒng)計(jì)，探討旗葉距、花藥大小及顏色與小孢子發(fā)育時(shí)期的相關(guān)性，為青稞花藥和小孢子培養(yǎng)的相關(guān)研究提供方法參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

供試青稞品種（系）為0841-6、T09-401、昆侖3號(hào)，均由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。這3個(gè)青稞材料均種植于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所溫室內(nèi)，管理同常規(guī)大田。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ? 取樣與測(cè)量? ? 2019年10 月中旬將供試青稞種子播種于溫室，2020年2月中下旬青稞現(xiàn)幼穗后取樣，每天9：00 — 10：00時(shí)采集健康且長(zhǎng)勢(shì)較好植株上的不同旗葉距的幼穗，做好標(biāo)記并放入自封口塑料袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。用游標(biāo)卡尺測(cè)量旗葉距，并分為五個(gè)區(qū)間：0～3 cm、 3～8 cm、8～13 cm、13～18 cm、 18～23 cm。每個(gè)區(qū)間取10個(gè)幼穗測(cè)定，重復(fù)3次。將幼穗從葉鞘中抽出，用鑷子輕輕剝?nèi)シf殼，取出花藥并用游標(biāo)卡尺測(cè)量長(zhǎng)度，記錄數(shù)據(jù)并拍照。

1.2.2? ? 壓片? ? 用鑷子取不同旗葉距幼穗中部的3枚花藥，置于載玻片上，滴1滴染色液使其完全浸沒(méi)，用玻璃棒擠壓花藥使小孢子游離出來(lái)，去掉花藥殘?jiān)?，染?1～2 min 后蓋上蓋玻片，吸去多余染液，用奧林巴斯 BX-51顯微鏡觀察小孢子發(fā)育狀況并拍照記錄。分別用改良苯酚品紅和醋酸洋紅染液染色，以選擇效果最好的染色液。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?染色液選擇及染色時(shí)間

制片能否成功主要受染色液和染色時(shí)間的影響，同時(shí)也影響小孢子的鏡檢結(jié)果。由圖1看出，改良苯酚品紅染色液更適合青稞游離小孢子的染色觀察，而經(jīng)醋酸洋紅染色的青稞游離小孢子背景比較混雜，不易觀察小孢子的各發(fā)育時(shí)期。染色時(shí)間不宜過(guò)短也不宜過(guò)長(zhǎng)，過(guò)短則達(dá)不到染色效果，過(guò)長(zhǎng)會(huì)將細(xì)胞染色太深不利于觀察，最佳染色時(shí)間為1.5～2.0 min。

2.2? ?青稞小孢子各發(fā)育時(shí)期的特征

通過(guò)對(duì)青稞小孢子各發(fā)育時(shí)期的觀察，表明小孢子的發(fā)育是連續(xù)的，1個(gè)花藥通常包含著不同發(fā)育時(shí)期的小孢子。如圖2所示，小孢子母細(xì)胞經(jīng)過(guò)第一次減數(shù)分裂形成的二分體（圖2 a），再進(jìn)一步進(jìn)行第二次減數(shù)分裂形成呈“田”字形的小孢子四分體。由圖2 b可見(jiàn)，光學(xué)顯微鏡下可以看到一層厚的胼胝質(zhì)將小孢子包裹著，不同發(fā)育時(shí)期小孢子呈不同形狀，規(guī)則的為圓形;之后胼胝質(zhì)酶將胼胝質(zhì)壁催化水解，小孢子從胼胝質(zhì)中分離出來(lái)被釋放至花粉囊中，此時(shí)小孢子具有不規(guī)則的外形輪廓，呈圓球形或紡錘形，細(xì)胞核較大，居中，也有稍偏離中央的，即單核居中期（圖2 c）。隨著小孢子從四周汲取養(yǎng)料，細(xì)胞體積逐漸增大，液泡也隨之增大，將細(xì)胞核推向細(xì)胞壁邊緣，即單核靠邊期（圖2 d）;隨后小孢子核進(jìn)行2次有絲分裂，最終發(fā)育成為成熟花粉粒，光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)花粉粒顏色變深但看不到細(xì)胞器，細(xì)胞膨大呈球形（圖2 e）。

2.3? ?青稞小孢子各發(fā)育時(shí)期與旗葉距的關(guān)系

通過(guò)觀察，將小孢子的發(fā)育時(shí)期分為二分體時(shí)期、四分體時(shí)期、單核早中期、單核靠邊期、雙核期和三核期等 6個(gè)時(shí)期。由于試驗(yàn)條件受限，雙核期和三核期難以區(qū)分，內(nèi)部特征觀察不明顯，將這 2 個(gè)時(shí)期合并為發(fā)育后期?；ㄋ庨L(zhǎng)度和花藥顏色也隨小孢子發(fā)育各個(gè)時(shí)期而有所變化。

在光學(xué)顯微鏡下對(duì)青稞品系0841-6不同時(shí)期小孢子進(jìn)行觀察的結(jié)果（表1）可以看出，當(dāng)旗葉距在 3～8 cm 時(shí)，主要以小孢子四分體時(shí)期為主，也有少量散落分布的二分體和單核早中期的小孢子，此時(shí)細(xì)胞質(zhì)顏色淺，細(xì)胞核易見(jiàn)。旗葉距增加到8～13 cm時(shí)，四分體小孢子逐漸減少，單核早中期小孢子數(shù)量居多，同時(shí)可觀察到單核靠邊期和成熟期小孢子。當(dāng)旗葉距在13～18 cm 時(shí)，單核靠邊期小孢子數(shù)量急劇增加達(dá)到峰值，四分體小孢子幾乎消失，單核早中期小孢子數(shù)量減少，同時(shí)出現(xiàn)成熟期小孢子。旗葉距>18 cm 時(shí)，單核早中期和靠邊期的小孢子減少甚至消失，視野內(nèi)以成熟期小孢子為主。

從表 2 和表3分別可以看出， T09-401和昆侖3號(hào)的小孢子發(fā)育時(shí)期與旗葉距的關(guān)系趨勢(shì)與0841-6基本一致。當(dāng)旗葉距在 3～8 cm 時(shí)，主要以小孢子四分體時(shí)期為主，旗葉距增加到8～13 cm時(shí)單核早中期小孢子數(shù)量居多，當(dāng)旗葉距為13～18 cm時(shí)單核靠邊期小孢子數(shù)量急劇增加并達(dá)到峰值，旗葉距>18 cm時(shí)視野內(nèi)以成熟期小孢子為主。細(xì)微的差別是T09-401旗葉距在18～23 cm時(shí)可觀察到單核早中期的小孢子，昆侖3號(hào)在旗葉距8～13 cm時(shí)未觀察到四分體時(shí)期的小孢子。

從圖 3 可以看出，0841-6、T09-401和昆侖3號(hào)各個(gè)時(shí)期的小孢子數(shù)量峰值都分別對(duì)應(yīng)不同的旗葉距區(qū)間。

3? ?結(jié)論與討論

單倍體育種在植物育種研究中具有重要應(yīng)用價(jià)值，花藥或花粉的離體培養(yǎng)是獲得單倍體的有效途徑，選擇適宜的小孢子發(fā)育時(shí)期是花藥或花粉離體培養(yǎng)取得成功的重要因素之一，小孢子發(fā)育時(shí)期的細(xì)微差別對(duì)花藥培養(yǎng)的產(chǎn)率將產(chǎn)生重大的影響[16 - 17 ]。不同物種最佳取材時(shí)期有差異，例如，在黃瓜小孢子培養(yǎng)中，以單核中后期的花粉培養(yǎng)效果最佳[18 ];Duijs[19 ]和Takahata等[20 ]的研究表明，甘藍(lán)花藥培養(yǎng)中小孢子最佳培養(yǎng)時(shí)期為單核中后期至雙核期，且雙核期小孢子占比對(duì)甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)影響重大;張德雙等[21 ]的研究認(rèn)為，綠菜花游離小孢子培養(yǎng)的最佳時(shí)期也是單核靠邊期至雙核期;王亦菲等[22 ]選取小孢子發(fā)育時(shí)期處于單核期的青稞花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)，成功獲得了小孢子再生植株。

在大量的花藥和小孢子離體培養(yǎng)過(guò)程中，采用顯微鏡逐個(gè)觀察很困難并且易污染，所以確定與小孢子發(fā)育時(shí)期相對(duì)應(yīng)的旗葉距大小形態(tài)指標(biāo)至關(guān)重要。由于其直觀性，利用旗葉距的大小來(lái)判斷小孢子發(fā)育時(shí)期在小孢子的離體培養(yǎng)中得到廣泛應(yīng)用。Mayakaduwa等[14 ]認(rèn)為水稻旗葉距為7～11 cm時(shí)為小孢子離體培養(yǎng)的最佳時(shí)期;在秈稻中，小孢子處于單核靠邊期時(shí)葉枕距為4～6 cm，為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)期[15 ];在大麥中，旗葉距在1.7～5.1 cm時(shí)，分離的小孢子數(shù)量最多[23 ];燕麥中旗葉距小于4 cm的圓錐花序能夠形成胚狀體[24 ]。試驗(yàn)取樣過(guò)程中，旗葉距是一個(gè)比較直觀的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，旗葉距的大小與小孢子發(fā)育時(shí)期有一定的相關(guān)性。以旗葉距為基本標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)結(jié)合顯微鏡觀察，來(lái)判斷最佳小孢子培養(yǎng)時(shí)期，可以降低實(shí)驗(yàn)誤差。

本研究表明，當(dāng)旗葉距在 0～3 cm 時(shí)，青稞主要以小孢子二分體時(shí)期為主，但由于試驗(yàn)條件受限，未對(duì)二分體時(shí)期小孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)。當(dāng)旗葉距為3～8 cm時(shí)，主要以小孢子四分體時(shí)期為主，也有少量散落分布的二分體和單核早中期小孢子，此時(shí)細(xì)胞質(zhì)顏色淺，細(xì)胞核易見(jiàn)。旗葉距增加到8～13 cm時(shí)，四分體小孢子逐漸減少，單核早中期小孢子數(shù)量居多，同時(shí)觀察到單核靠邊期和成熟期小孢子。當(dāng)旗葉距在13～18 cm 時(shí)，單核靠邊期小孢子數(shù)量急劇增加達(dá)到峰值，四分體小孢子幾乎消失，單核早中期小孢子數(shù)量減少，同時(shí)出現(xiàn)成熟期小孢子。旗葉距>18 cm 時(shí)，單核早中期和靠邊期小孢子減少至消失，視野內(nèi)以成熟期小孢子為主。花藥長(zhǎng)度和顏色也隨小孢子發(fā)育而產(chǎn)生變化，3 個(gè)供試青稞材料的總體趨勢(shì)一致。該結(jié)果有助于提高青稞花藥和小孢子離體培養(yǎng)時(shí)小孢子取材的準(zhǔn)確性和效率。

參考文獻(xiàn)：

[1] 胡再青，劉梅金，徐冬麗，等.? 甘南高寒陰濕區(qū)甘青6號(hào)青稞種植密度與肥料配比試驗(yàn)初報(bào)[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2018（11）：10-12.

[2] 劉廣才，馬? ?彥，張忠賢，等.? 甘肅青稞寬幅勻播綠色高產(chǎn)栽培技術(shù)規(guī)程[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2018（7）：87-90.

[3] 劉小嬌，王姍姍，白? ?婷，等.? 青稞營(yíng)養(yǎng)及其制品研究進(jìn)展[J].? 糧食與食品工業(yè)，2019，26（1）：43-47.

[4] 包雪梅，謝惠春.? 青稞主要成分及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].? 現(xiàn)代食品，2019（2）：43-47.

[5] 鄭學(xué)玲，張玉玉，張? ?杰.? 青稞淀粉理化特性的研究[J].? 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2011，26（4）：30-36.

[6] 張? ?峰，楊? ?勇，趙國(guó)華，等.? 青稞β-葡聚糖研究進(jìn)展[J].? 糧食與油脂，2003（12）：3-5.

[7] 那成龍，陳建澍，張玉紅，等.? 大麥β-葡聚糖的提取及功能研究進(jìn)展[J].? 麥類作物學(xué)報(bào)，2012，32（3）：579-584.

[8] 李? ?健，豐先紅，蔡一林.? 青藏高原青稞育成品種的親緣系數(shù)分析[J].? 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，52（16）：2758-2767.

[9] MARTIN J M，BLAKE T K，HOCKETT E A. Diversity among north American spring barley cultivars based on coefficients of parentage[J].? Crop Science，1991，31（5）：1131-1137.

[10] REN X F，NEVO E，SUN D F，SUN G L. Tibet as a potential domestication center of cultivated barley of China[J].? PLos One， 2013，8（5）：e62700.

[11] 謝從華，柳? ?俊.? 植物細(xì)胞工程[M].? 北京：高等教育出版社，2004.

[12] 李允菲，王仁濤，袁存權(quán)，等.? 紅花槐花藥培養(yǎng)最適取材時(shí)期及選蕾標(biāo)準(zhǔn)[J].? 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，41（8）：65-71.

[13] 高潤(rùn)紅，郭桂梅，何? ?婷，等.? 大麥‘花30旗葉距對(duì)小孢子發(fā)育時(shí)期、愈傷組織誘導(dǎo)以及綠苗再生的影響[J/OL].? 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：1-8[2020-04-22].? http：//kns.cnki.net/kcms/detail/32.1148.s.20200331.1514.002.html.

[14] MAYAKADUWA D M R G，Silva T D.? A cytological indicator allows rapid assessment of microspore maturity，leading to improved in vitro anther response in Indica rice（Oryza sativa L.）[J].? In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2017，53（6）：591-597.

[15] 胡? ?銳.? 秈稻花藥培養(yǎng)影響因素的研究[D].? ?武漢：湖北大學(xué)，2015：24.

[16] WILLCOX M C，REED S M，BURNS J A， et al.? Effect of microsporestage and media on anther culture of peanut（Arachishy pogaea L.） [J].? Plant Cell Tissue Organ Culture，1991，24：25-28.

[17] MC CORMICK S.? Male gametophyte development[J].? Plant Cell，1993（5）：1265-1275.

[18] 謝? ? 淼，秦麗穎，潘俊松，等.? 黃瓜花器形態(tài)發(fā)生、小孢子發(fā)育與花藥培養(yǎng)[J].? 西北植物學(xué)報(bào)，2005，25（6）：1096-1100.

[19] DUIJS J C.? Microspore culture is successful in most crop types of Brassica oleracea L.[J].? Euplytica，1992，60：45-55.

[20] TAKAHATA Y，KELLER W A. High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore culture of Brassica oleracea L.[J]. Plant Sci，1991，74：235-242.

[21] 張德雙，曹鳴慶，秦智偉.? 綠菜花雙核期小孢子比例對(duì)游離小孢子培養(yǎng)的影響[J].? 園藝學(xué)報(bào)，1998，25（2）：201-202.

[22] 王亦菲，陸瑞菊，陳志偉，等.? 青稞花藥的離體培養(yǎng)與植株再生[J].? 植物生理學(xué)通訊，2010，46（7）：745-746.

[23] ESTEVES P，BELZILE F.? Improving the efficiency of isolated microspore culture in six-row spring barley：I-optimization of key physical factors[J].? Plant Cell Reports，2014， 33（6）：993-1001.

[24]WARCHO?M，CZYCZYO-MYSZA I， MARCISKA I，et al. Factors inducing regeneration response in oat（Avena sativa L.） anther culture[J].? In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2019，55（5）：595-604.

（本文責(zé)編：鄭立龍）