薛玉峰 葉麗君 傅攀

[摘要] 目的 探討miR-135a和miR-146a在阿爾茨海默?。ˋD）患者中的表達(dá)及臨床意義，為AD的診斷提供依據(jù)。 方法 選取2017年6月—2019年5月浙江省臺州市第一人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）神經(jīng)內(nèi)科住院的65例AD患者為AD組，另選取同期在我院體檢的30名健康體檢者作為對照組。采用實時熒光定量PCR檢測miR-135a和miR-146a表達(dá)水平，受試者工作特征（ROC）曲線評價miR-135a和miR-146a對AD診斷效能。 結(jié)果 AD組miR-135a表達(dá)低于對照組，miR-146a表達(dá)高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）。miR-135a診斷AD的臨界值為0.825，敏感度為0.923，特異性為0.700;miR-146a診斷AD的臨界值為2.065，敏感度為0.877，特異性為0.900。 結(jié)論 AD患者中miR-135a表達(dá)下調(diào)，miR-146a表達(dá)上調(diào)，對AD有較高的診斷效能。

[關(guān)鍵詞] 阿爾茨海默病;miR-135a;miR-146a;表達(dá)

[中圖分類號] R749.16 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）08（b）-0016-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of miR-135a and miR-146a in patients with Alzheimer′s disease （AD）， and to provide evidence for the diagnosis of AD. Methods Sixty-five patients with AD who admitted to Department of Neurology， the First People′s Hospital of Taizhou of Zhejiang Province （“our hospital”for short） from June 2017 to May 2019 were enrolled in AD group. In addition， 30 healthy subjects who underwent physical examination in our hospital during the same period were selected as control group. The expression levels of miR-135a and miR-146a were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and the diagnostic efficacy of miR-135a and miR-146a in AD were evaluated by receiver operating characteristic （ROC） curve. Results The expression of miR-135a in AD group was lower than that in control group， and the expression of miR-146a was higher than that in control group， with statistically significant differences （all P < 0.05）. The cut-off value of miR-135a in the diagnosis of AD was 0.825， the sensitivity was 0.923， and the specificity was 0.700. The cut-off value of miR-146a in the diagnosis of AD was 2.065， the sensitivity was 0.877， and the specificity was 0.900. Conclusion The expression of miR-135a is down-regulated， the expression of miR-146a is up-regulated in AD patients， which have a higher diagnostic efficacy for AD.

[Key words] Alzheimer′s disease; MiR-135a; MiR-146a; Expression

阿爾茨海默?。ˋD）是一種進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，起病隱匿，臨床癥狀通常表現(xiàn)為記憶障礙、失語、失認(rèn)、執(zhí)行功能障礙、視空間技能損害及行為和人格改變等的全面性癡呆，病因未明。隨著我國人口老齡化越來越嚴(yán)重，AD發(fā)病率有增加趨勢，給社會帶來越來越重的負(fù)擔(dān)，因此，對AD的早期診療有重要意義[1]。微小核糖核酸（miRNA）是由18～25個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化，突觸和神經(jīng)突的可塑性增長，與AD的發(fā)病機制有關(guān)[2]。本研究旨在探討miR-135a和miR-146a在AD患者中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月—2019年5月浙江省臺州市第一人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）神經(jīng)內(nèi)科住院的65例AD患者為AD組，同期選取我院30名健康體檢者為對照組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①參考《精神病診斷和統(tǒng)計手冊》[3]的診斷標(biāo)準(zhǔn);②年齡61～90歲;③記憶能力或認(rèn)知功能下降≥6個月;④受教育年限≥5年。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重的心腦血管、肝臟、腎臟等疾病者;②精神病患者;③依從性差者。本研究均經(jīng)患者及家屬知情同意，并簽署知情同意書，且本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 ?清晨采集受試者空腹外周血4 mL于枸櫞酸鈉抗凝管內(nèi)，3000 r/min離心10 min（離心半徑80 mm），分離血漿置于-80℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.2.2 miR-135a和miR-146a的檢測 ?400 μL患者血漿用RNA提取液（Qiagen公司，USA，批號：157037 881）提取總miRNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Qiagen公司，USA，批號：160029569）以25℃ 10 min，50℃ 30 min，85℃ 5 min為條件逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。7500型實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（ABI公司，USA）進(jìn)行擴增。miR-135a上游引物5′-GGGTAGAGTTTGTGTGTTG-CC-3′，下游引物：5′-TCTTCTTCCACCTCAGCCAC-3′;miR-146a上游引物：5′-CCGCCGTGAGAACTGAAT-TCCA-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAG-AAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min;95℃變性10 s，60℃退火45 s，40個循環(huán);72℃延伸 5 min。采用2-ΔΔCt的方法計算所測血漿標(biāo)本miR-135a和miR-146a的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗;受試者工作特征（ROC）曲線對診斷效能進(jìn)行評價。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組性別、年齡、高血壓病、糖尿病和教育程度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性;AD組簡易精神狀態(tài)量表[3]（MMSE）評分低于對照組（P < 0.05）。見表1。

2.2 兩組miR-135a和miR-146a表達(dá)水平比較

AD組miR-135a表達(dá)低于對照組，miR-146a表達(dá)高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）。見表2。

2.3 miR-135a和miR-146a對AD的診斷效能

miR-135a診斷AD的臨界值為0.825，敏感度為0.923，特異性為0.700;miR-146a診斷AD的臨界值為2.065，敏感度為0.877，特異性為0.900。見表3，圖1。

3 討論

隨著社會的發(fā)展、人口老齡化的加快，AD的患病率呈上升趨勢。據(jù)報道，全世界65歲以上AD患者多達(dá)5000萬例，并且到2020年將增加到7500萬例[4]。miRNA是一類內(nèi)源性短鏈非編碼核糖核酸，miRNA位于3′非翻譯區(qū)的特定的互補序列部分，用于調(diào)節(jié)miRNA的降解和翻譯[5-6]。

AD是一種與年齡相關(guān)的退行性疾病，主要病理表現(xiàn)為大腦海馬區(qū)的Aβ在細(xì)胞外沉積形成老年斑，而β分泌酶是β-淀粉樣蛋白（Aβ）生成的限速酶，tau蛋白的過度磷酸化導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纏結(jié)，腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞減少，新皮層、腦血管改變[7-9]。Aβ作為機體的正常代謝物，可以由淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）水解得來，但當(dāng)APP功能出現(xiàn)異常，就會導(dǎo)致Aβ異常沉積，最終造成神經(jīng)細(xì)胞毒性作用[10-11]。同時，AD也有可能由氧化應(yīng)激和炎癥導(dǎo)致[12-13]。miRNA在腦組織中表達(dá)豐富，可調(diào)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)多種靶基因，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育分化起重要的調(diào)節(jié)作用。神經(jīng)系統(tǒng)中miRNA相關(guān)蛋白的異常調(diào)節(jié)與神經(jīng)退行性疾?。ˋD、帕金森病等）密切相關(guān)[14-15]。miRNA在AD中可能參與以下過程：①參與Aβ、tau蛋白病理相關(guān)的基因表達(dá)水平調(diào)控;②神經(jīng)元的代謝與凋亡;③記憶功能減退。因此，miRNA有可能成為AD診斷的標(biāo)志物和治療新靶點[16-17]。

miR-135a是miR-135家族的重要成員之一，具有抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能，其在肝癌、前列腺癌和骨肉瘤等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[18-20]。陳李芳等[21]報道m(xù)iR-135a在AD組患者血清中表達(dá)顯著低于對照組，miR-135a有望成為AD早期診斷的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，AD組miR-135a表達(dá)量低于對照組（P < 0.05），與劉辰庚等[22]結(jié)果一致。miR-146a是κ基因結(jié)合核因子（NF-κB）的依賴性基因，并且通過抑制人類單核細(xì)胞腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）和白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶1（IRAK1）下調(diào)NF-κB的表達(dá)，在固有免疫、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、癌癥發(fā)生等生物學(xué)過程中均發(fā)揮重要作用[23]。miR-146a可以直接靶向補體因子H（CFH），β-APP相關(guān)的蛋白和IRAK-1導(dǎo)致AD大腦炎癥反應(yīng)增加，miR-146a的水平與AD大腦中的老年斑密度和突觸病理呈正相關(guān)[24]。AD的發(fā)生與免疫功能紊亂密切相關(guān)，AD患者海馬和額葉皮質(zhì)中miR-146a表達(dá)顯著上調(diào)，核轉(zhuǎn)錄因子可誘導(dǎo)其表達(dá)，CFH是腦組織內(nèi)重要的具有免疫抑制功能的因子，而增高的miR-146a能抑制CFH表達(dá)，導(dǎo)致AD患者神經(jīng)元持續(xù)炎癥反應(yīng)[25]。有學(xué)者認(rèn)為，載脂蛋白E基因等位基因e4（apoE4）是AD的普遍遺傳危險因素[26]。Arena等[27]在AD的海馬中發(fā)現(xiàn)miR-146a表達(dá)增加，并且與其目標(biāo)IRAK-1呈負(fù)相關(guān)，miR-146a可能參與大腦發(fā)育和神經(jīng)變性。本研究結(jié)果顯示，miR-146a在AD患者外周血中表達(dá)顯著上調(diào)，曲線下面積為0.921，具有較高的診斷效能。

綜上所述，miR-135a在AD患者外周血中表達(dá)的下調(diào)，miR-146a表達(dá)上調(diào)，對AD的診斷有一定的應(yīng)用價值。

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（收稿日期：2020-01-07）