閆會(huì)敏，高會(huì)霞，王瑜玲，盧建華，趙磊，丁芳，劉玉珍，戴二黑

(1.石家莊市第五醫(yī)院,a.研究所，b.檢驗(yàn)科，c.內(nèi)二科，石家莊050021；2.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，石家莊050017)

由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)感染引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)自2019年底出現(xiàn)以來(lái)，疫情快速在全球蔓延[1]。大多數(shù)COVID-19患者表現(xiàn)為輕中度癥狀，但部分患者可進(jìn)展為嚴(yán)重的肺炎，甚至出現(xiàn)器官功能衰竭和死亡[2]。在SARS-CoV-2感染的不同階段，COVID-19患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和細(xì)胞因子、趨化因子水平可能存在差異。石家莊市第五醫(yī)院作為石家莊市定點(diǎn)收治醫(yī)院已收治COVID-19患者21例，現(xiàn)將21例患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和細(xì)胞因子水平進(jìn)行綜合分析，以期為SARS-CoV-2感染的診治和防控提供借鑒。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 納入2020年1月21日至2月10日石家莊市第五醫(yī)院收治的COVID-19確診病例21例，其中輕型患者4例，普通型患者12例，重型患者5例。COVID-19診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)參考《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第七版)》，所有患者均經(jīng)過(guò)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)和胸部CT掃描，治療措施包括對(duì)癥治療、抗病毒治療和呼吸支持等。本研究通過(guò)石家莊市第五醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2標(biāo)本采集與處理 取含抗凝劑和促凝劑的真空采血管，分別采集患者清晨空腹靜脈血。EDTA-K2抗凝管靜脈血標(biāo)本用于檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo)和T細(xì)胞亞群的絕對(duì)數(shù)；促凝管靜脈血標(biāo)本靜置30 min后，3 000 r/min離心分離血清，其中一管檢測(cè)肝腎功能相關(guān)指標(biāo)等，另一管置于-80 ℃保存，1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞因子和趨化因子水平；枸櫞酸鈉抗凝管靜脈血標(biāo)本2 000 r/min離心分離血漿后用于檢測(cè)凝血功能。

1.3儀器與試劑 血細(xì)胞分析儀及其配套試劑、全自動(dòng)血凝分析儀及其配套試劑(日本Sysmex公司)，全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)，F(xiàn)ACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，ProcartaPlex多細(xì)胞因子檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)ThermoFisher公司)；TriTEST CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE抗體和溶血素(美國(guó)BD公司)，生化指標(biāo)檢測(cè)試劑(上?？迫A公司)。

1.4常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè) 用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(L)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(N)、血紅蛋白(Hb)；用生化分析儀檢測(cè)血液肝功能、腎功能、血糖和血脂等相關(guān)指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(T-Bil)、谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶(GGT)、清蛋白(Alb)、膽堿酯酶(ChE)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、葡萄糖(Glu)、鈣(Ca2+)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、C反應(yīng)蛋白(CRP)；用全自動(dòng)血凝分析儀檢測(cè)凝血功能指標(biāo)，包括凝血酶時(shí)間(TT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、纖維蛋白原(Fib)、活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)、D-二聚體(D-Dimer)。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群 取EDTA-K2抗凝血50 μL置于流式細(xì)胞管，加入10 μL TriTEST CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE抗體，室溫避光溫育15 min，加入溶血素 2 mL，溫育15 min后離心，PBS洗滌2次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6血清細(xì)胞因子和趨化因子檢測(cè) 用ProcartaPlex多細(xì)胞因子檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)血清中34種細(xì)胞因子和趨化因子水平，包括IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-1α、IL-1RA、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-31、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白(eotaxin)、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌因子-α(GRO-α)、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10(IP-10)、單核細(xì)胞趨化因子(MCP-1)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-1α、MIP-1β、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)、調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的趨化因子(RANTES)。具體方法為：將50 μL磁珠加入微孔板，離心棄去液體后，每孔加入25 μL緩沖液和25 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，室溫反應(yīng)60～120 min，清洗微孔板2次，加入25 μL檢測(cè)抗體混合液溫育30 min后，洗滌，再加入鏈霉親和素-熒光色素偶聯(lián)物溫育30 min。采用LuminexTM200流式熒光檢測(cè)儀讀取數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1基本臨床特征 21例患者中，男15例(71.4%)，女6例(28.6%)，男女比為5∶2。重型、普通型和輕型患者的比例分別為23.8%、57.1%和19.1%。重型患者年齡為(60.4±12.8)歲，高于普通型[(41.3±14.8)歲]和輕型[(28.8±29.3)歲]患者。來(lái)自或發(fā)病前到過(guò)武漢市及湖北其他地區(qū)的患者共10例(47.6%)。10例(47.6%)具有高血壓、肺結(jié)核、脂肪肝等基礎(chǔ)性疾病。經(jīng)治療后全部好轉(zhuǎn)，無(wú)死亡患者。

2.2不同臨床分型患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)水平 見(jiàn)表1。與輕型和普通型患者比較，重型患者WBC、L、T-Bil、Alb、ChE、TT和Ca2+濃度下降，CRP水平升高。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示,CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量下降。

表1 不同臨床分型患者實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

2.3不同臨床分型患者細(xì)胞因子和趨化因子的水平 見(jiàn)表2。與輕型患者比較，普通型和重型患者IL-8水平升高，而IP-10、MIP-1α和MIP-1β水平隨疾病嚴(yán)重程度增加而升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余23個(gè)因子僅能在個(gè)別患者中檢出。

表2 不同臨床分型患者細(xì)胞因子和趨化因子的水平

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)石家莊市COVID-19患者以成年人為主，重型患者占23.8%，與已有研究結(jié)果相近[3]。重型患者WBC、T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，IL-8、IP-10、MIP-1α和MIP-1β水平增高，證實(shí)T細(xì)胞耗竭和炎性因子增高可能是COVID-19重型化的關(guān)鍵免疫學(xué)因素[4-5]，提示有效降低細(xì)胞因子水平可能改善COVID-19患者的肺損傷。與細(xì)胞因子不同，COVID-19患者CRP水平與臨床分型呈正相關(guān)，提示CRP可以反映患者病情嚴(yán)重程度。

COVID-19患者存在明顯的肝功能異常[6-7]，這一現(xiàn)象在本研究中也得到證實(shí)。COVID-19患者肝損傷發(fā)生的原因可能與以下因素有關(guān)：一是全身性炎癥反應(yīng)的影響；二是SARS-CoV-2病毒以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)受體依賴的方式引起膽管上皮細(xì)胞受損，并以非ACE2受體依賴的方式感染免疫細(xì)胞，參與對(duì)肝組織的感染和損害[8]。另外，一些臨床藥物可能具有潛在的不良反應(yīng)，有必要選擇治療后患者進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)COVID-19重型患者Glu水平增高，而血清Ca2+水平下降。最新研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2病毒可通過(guò)ACE2受體進(jìn)入細(xì)胞破壞胰島[9]，使糖尿病病情加重；而糖尿病患者長(zhǎng)期處于代謝性炎癥狀態(tài)，抗感染能力低下[10]，兩者相互作用使病情加重。SARS-CoV-2感染如何影響Ca2+水平尚未見(jiàn)報(bào)道，由于血清Ca2+水平與糖尿病患者血糖控制狀況密切相關(guān)[11]，因此補(bǔ)充鈣、改善高血糖癥，可能有助于患者康復(fù)。