徐 迪 馬 康 單吉浩 李建勛

(1中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；2中國計量科學研究院，北京 100029)

鎮(zhèn)靜劑類藥物是一類通過抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)減弱其生理機能而達到緩和激動、消除躁動、恢復安靜情緒的藥物[1-2]。近年來，有些不法畜牧業(yè)主為了追求經(jīng)濟利益最大化，在畜禽飼料中違法添加鎮(zhèn)靜劑類藥物，以達到降低動物運動量和增重催肥的目的[3]。此外，在動物運輸過程中也常常使用此類藥物來減少動物體重下降以及防止肉品質(zhì)降低[4-5]。非法使用鎮(zhèn)靜劑類藥物會導致藥物殘留在各種動物源食品中，食用此類食品會對人體神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生較大的危害[6]。目前，國際食品法典委員會(codex alimentarius commission，CAC)、歐盟、澳大利亞等國家或組織均對畜肉中鎮(zhèn)靜劑的最高限量值做出了相關規(guī)定[7]。我國則將鎮(zhèn)靜劑類藥物列為禁用藥物，規(guī)定動物源食品中不得檢出此類藥物[8-9]。

目前，鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留檢測方法主要有酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)法[10]、高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC) 法[11-14]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(gas chromatography-tandem mass spectrometery，GC-MS/MS)法[15-18]和超高液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatogram-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)法[19-25]。其中ELISA 法檢測結(jié)果易出現(xiàn)假陽性結(jié)果；HPLC 法靈敏度低，且色譜峰易受到各種基質(zhì)成分的干擾，易造成定量不準確；GCMS/MS 法需對樣品進行衍生化，導致檢測周期長；而UPLC-MS/MS 法可以彌補前幾種方法的缺陷，該技術(shù)無需衍生化處理，且其選擇性高、靈敏度高、特異性強。已有針對動物源性食品和血液中鎮(zhèn)靜劑類藥物檢測的文獻報道[26-27]，然而對動物尿液中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留檢測方法的報道較少。因此，本試驗采用UPLC-MS/MS技術(shù)，以期建立豬、牛、羊尿液中5 種常見鎮(zhèn)靜劑類藥物異丙嗪亞砜、異丙嗪、氯丙嗪、安眠酮和地西泮殘留的測定方法，為我國相關監(jiān)管部門提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

豬尿、牛尿、羊尿取自于河北、天津、海南三省的生豬、生牛和生羊屠宰場。

異丙嗪亞砜、異丙嗪、氯丙嗪、安眠酮和地西泮標準品，天津阿爾塔科技有限公司；甲醇、乙腈(質(zhì)譜純)，美國Fisher 公司；甲酸、乙酸(色譜級)，美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設備

Triple Quad 6495 三重四級桿質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；3K15 離心機，美國Sigma 公司；Vortex-genie 2 渦旋混合器，德國IKA 公司；AG245 分析天平，瑞士Metler Toledo 公司；DSY-Ⅲ水浴型氮吹儀，北京東方精華苑科技有限公司；Oasis MCX 固相萃取柱(3 mL，60 mg)，美國Waters 公司；Milli-Q 純水儀，美國Millipore公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 混合標準工作溶液配制 分別準確稱取10.0 mg 氯丙嗪、異丙嗪、安眠酮、異丙嗪亞砜和地西泮標準品，用甲醇溶解、定容、混勻，配制成1.0 g·L-1的標準儲備溶液。精密量取各標準儲備溶液于容量瓶中，甲醇定容，配制成10.0 mg·L-1的混合標準中間溶液，再用甲醇將其稀釋成不同濃度的標準工作溶液。以上標準溶液均避光-18℃保存。

1.3.2 樣品前處理 準確量取2.0±0.05 mL 尿液(豬尿、牛尿、羊尿)于50 mL 具塞離心管中，8 000 r·min-1離心5 min，上清液用5%乙酸水溶液調(diào)pH 值至3.0，然后過Oasis MCX 柱凈化:首先依次用3 mL甲醇和3 mL 水對MCX 柱進行預處理，然后將上清液加載在MCX 小柱上，再依次用3 mL 水和3 mL 40%甲醇水溶液洗柱，棄去淋洗液，真空抽干MCX 小柱1 min，取3 mL 5%氨化甲醇進行洗脫，洗脫液在45℃條件下氮氣流吹干，加入2 mL 0.1%甲酸溶液/乙腈(v/v，8/2)溶解復溶，過0.22 μm 濾膜，供UPLC-MS/MS檢測。

1.3.3 色譜條件 色譜柱:Agilent Poroshell 120ECC18 柱(50 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流動相A:0.1%甲酸水溶液；流動相B:乙腈；梯度洗脫條件:0～1.0 min，90% A；5.0 min，25% A；5.5 ～6.0 min，15% A；7.0 ～8.0 min，1% A；9.0 ～10.0 min，90%A；柱溫:45℃；流動相流速:0.4 mL·min-1；進樣量:10 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧電離源(ESI)；掃描方式:正離子掃描；檢測方式:多重反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)；毛細管電壓:2.5 kV；噴嘴電壓:2.0 kV；干燥氣溫度:200℃；錐孔反吹氣流速:50 L·h-1；脫溶劑氣溫度和流量分別為380℃和660 L·h-1；定性離子對、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量見表1。

1.3.5 方法學考察及基質(zhì)效應評價 取不含待測藥物的豬尿、牛尿、羊尿的空白基質(zhì)，添加濃度分別為0.6、2.5 和9.0 μg·L-1的鎮(zhèn)靜劑類藥物，按1.3.2 方法處理后，按1.3.3 色譜條件進行樣品分析，每個濃度重復5 次，考察回收率與精密度；分別以3 倍、10 倍信噪比(signal-noise ratio，S/N)計算檢出限和定量限:5 種鎮(zhèn)靜劑類藥物在豬尿、牛尿和羊尿中受到的基質(zhì)效應根據(jù)其在濃度為2.5 μg·L-1的基質(zhì)匹配標準溶液和同等濃度的溶劑標準溶液中的響應比值來計算，即基質(zhì)效應(matrix effect，ME)＝(基質(zhì)匹配標準溶液在儀器上的響應值-溶劑標準溶液在儀器上的響應值)/溶劑標準溶液在儀器上的響應值×100%[28]。根據(jù)ME 值可將其分為三類:ME＜-20%定義為基質(zhì)抑制效應；-20%≤ME≤20%定義為弱基質(zhì)效應；ME>20%定義為基質(zhì)增強效應。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0 以及Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)處理及分析，采用Origin 8.6 軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

歐盟規(guī)定對于禁用獸藥殘留定性確證的要求，至少需要4 個確證點。本試驗選擇每個獸藥的母離子和對應的兩個響應較高的子離子進行定性，一個母離子和一個子離子分別為1 個和1.5 個確證點，共4 個確證點，滿足定性要求。兩個子離子中豐度高的最為定量離子，并通過一系列碰撞能量條件優(yōu)化，確定5 種鎮(zhèn)靜劑類獸藥串聯(lián)質(zhì)譜分析的最佳碰撞能量。5 種鎮(zhèn)靜劑類獸藥的定性和定量離子對以及碰撞能量等參數(shù)見表1。

2.2 基質(zhì)效應評價

基質(zhì)效應可分為對分析物信號響應的增強效應、弱基質(zhì)效應和抑制效應，最終會影響定量結(jié)果的準確性[29]。由表2可知，5 種鎮(zhèn)靜劑類藥物在3 種尿樣均顯示出弱基質(zhì)效應，更多地顯示出弱基質(zhì)抑制效應。這可能是由于尿液中雜質(zhì)成分與目標分析物競爭性進入離子源被檢測，導致弱基質(zhì)抑制效應。綜上，基質(zhì)效應不顯著，對定量結(jié)果的影響較小，因此可直接采用溶劑標準溶液代替基質(zhì)匹配標準溶液對目標物進行定量分析，從而降低實驗周期，提高檢測效率。

表1 5 種鎮(zhèn)靜劑的定性、定量離子對和最佳碰撞能量Table1 Quantitative and qualitative ions，and optimized collision energies for the five sedatives

表2 不同尿樣中5 種鎮(zhèn)靜劑藥物的基質(zhì)效應Table2 ME for the five sedatives in different urine samples/%

2.3 方法學考察

2.3.1 線形范圍、檢出限和定量限 用甲醇稀釋混合標準中間溶液配制成0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0 和20.0 μg·L-1系列標準工作液。以目標物的質(zhì)量濃度為橫坐標(x，μg·L-1)，其定量離子色譜峰面積(y)為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果見表3。5 種鎮(zhèn)靜劑在0.6～20.0 μg·L-1內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)(R2) 均大于0.993。5 種鎮(zhèn)靜劑類藥物檢出限均為0.1 μg·L-1，定量限均為0.6 μg·L-1，證實該方法靈敏度高，可滿足日常檢測需要。

2.3.2 方法的準確度與精密度 本試驗通過豬尿、牛尿和羊尿加標回收試驗對方法準確度和精密度進行評價，各藥物的回收率和精密度見表4。結(jié)果表明，5 種鎮(zhèn)靜劑藥物的平均回收率為64.6%～110.2%，相對標準偏 差(relative standard deviation，RSD) 均小于6.0%，證實本方法具有很好的準確度和精密度。

2.4 實際樣品檢測

隨機抽取屠宰場中豬、牛、羊尿各15 份，采用本試驗建立的方法和中國檢驗檢疫行業(yè)標準方法[27]分別對其進行檢測，均未檢測出5 種鎮(zhèn)靜劑藥物殘留，證實該方法是準確、可靠的。

表3 5 種鎮(zhèn)靜劑類藥物的線性范圍、檢出限與定量限Table3 Linear ranges，limit of detection and limit of quantitation of five sedatives

表4 豬尿、牛尿和羊尿中5 種鎮(zhèn)靜劑藥物準確度和精密度試驗結(jié)果(n＝5)Table4 Average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the five sedatives in pig urine，cow urine and sheep urine (n＝5)

3 討論

本研究采用UPLC-MS/MS 法測定5 種鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留，省略了采用氣相色譜法檢測所必需的衍生化過程，很大程度縮短了試驗周期。已有研究表明，采用UPLC-MS/MS 法能夠有效測定動物源食品的鎮(zhèn)靜劑類藥物[6]，但針對不同樣品的基質(zhì)、凈化和提取條件差異較大。朱群英等[1]在檢測豬肉樣品中鎮(zhèn)靜劑類藥物時，以乙酸乙酯為提取劑，經(jīng)Oasis HLB 固相萃取柱凈化后，鎮(zhèn)靜劑類藥物回收率為88.5% ～115.0%。劉家陽等[7]選取鹽酸溶液提取畜肉中的鎮(zhèn)靜劑類藥物，經(jīng)MCX 固相萃取凈化后，鎮(zhèn)靜劑類藥物回收率為71.6%～112.0%；本研究利用Oasis MCX 固相萃取小柱凈化，UPLC-MS/MS 分析測定豬、牛、羊尿中5 種鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留含量，其回收率為64.6%～110.2%，符合殘留檢測要求。但與孟蕾等[2]的研究結(jié)果相比，本研究測定的鎮(zhèn)靜劑類藥物回收率范圍較大，其原因可能是本試驗測定不同動物源尿液樣品中含有的物質(zhì)有一定差異性，同一種固相萃取小柱對不同尿液凈化能力不同，導致回收率范圍較寬。因此，在今后的工作中，可針對不同動物尿液自身的特性，對多種不同的提取溶劑和凈化小柱進行考察，開展多樣的提取和凈化條件篩選工作。

本研究利用乙腈對動物尿液中鎮(zhèn)靜劑類藥物進行提取，采用固相萃取柱去除尿液中雜質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，步驟操作簡單，且針對動物尿液這類相對比較簡單的基質(zhì)，通過基質(zhì)效應考察發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)效應并不明顯，故可以直接采用溶劑標準溶液對目標物進行定量分析，從而省略了每批樣品配置基質(zhì)匹配標準溶液的繁雜步驟，整個前處理過程在10 min 內(nèi)即可完成，實現(xiàn)了動物尿液中鎮(zhèn)靜劑類獸藥殘留的快速檢測。國標方法[30]是在堿性條件下利用特丁基甲醚對基質(zhì)中鎮(zhèn)靜劑類藥物進行提取，前處理過程涉及水浴和多次提取的步驟，前處理過程約2.5 h，儀器檢測時間長達1 h，是該方法儀器檢測時長的6 倍。因此，本研究的分析方法具有速度快、靈敏度高和重現(xiàn)性好的特點，可適用于大批量的不同動物尿液中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留的快速檢測。

4 結(jié)論

本研究采用固相萃取柱凈化方式，建立了UPLCMS/MS 法測定動物尿樣中5 種鎮(zhèn)靜劑類獸藥殘留的檢測方法，基質(zhì)效應不明顯，因此采用溶劑標準工作曲線定量。采用該方法對豬、牛、羊尿中的5 種鎮(zhèn)靜劑獸藥殘留檢測顯示出良好的萃取效果，加標回收率在64.6%～110.2%之間，RSD 均小于6.0%，定量限為0.6 μg·L-1，該方法準確度高，穩(wěn)定性好，靈敏度高，各項指標均能滿足豬、牛、羊尿中鎮(zhèn)靜劑類獸藥殘留檢測分析的要求，可為不同動物尿液中鎮(zhèn)靜劑類藥物的常規(guī)檢測提供有力幫助。