張 淳 許麗華

成牙本質(zhì)細(xì)胞位于牙髓最外圍，是最早接觸外界刺激的細(xì)胞，可以更早更敏感的反映牙髓組織的損傷修復(fù)反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究不同齲深標(biāo)本中成牙本質(zhì)細(xì)胞的凋亡情況及Bcl-2、Bax的表達(dá)情況，探討B(tài)cl-2、Bax在齲病進(jìn)展中的變化規(guī)律。

資料和方法

一、實(shí)驗(yàn)主要儀器和試劑

石蠟包埋機(jī)、RM2255半自動(dòng)切片機(jī)、303AS-1型數(shù)顯隔水式培養(yǎng)箱、CX41多功能顯微鏡、CX40多功能顯微鏡、Bcl-2及Bax鼠抗人單克隆抗體、超敏型二步法檢測(cè)試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。

二、實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

經(jīng)患者知情同意，選牙根發(fā)育完成且可完整拔除，但無(wú)治療與保留價(jià)值的第三磨牙，病損均為牙合面慢性齲，正常牙、淺齲、中齲和深齲各20顆。拔出后即刻截根固定，脫鈣，石蠟包埋、切片。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.HE染色：HE染色，光鏡下（400倍）測(cè)量100μm成牙本質(zhì)細(xì)胞層長(zhǎng)度的成牙本質(zhì)細(xì)胞數(shù)目，測(cè)定區(qū)域選擇在髓頂中部下方，如果有修復(fù)性牙本質(zhì)形成，測(cè)量其下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞數(shù)目。

2.TUNEL染色：切片脫蠟至水，胰蛋白酶消化液37℃孵育30min，TUNEL反應(yīng)混合液37℃孵育1h，converter-POD 37℃ 孵 育 30min，DAB 顯 色5min，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。陰性對(duì)照省略TdT。

胞核2/3為棕黃色或褐色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。觀察部位及計(jì)數(shù)方法同HE染色。計(jì)算凋亡指數(shù)：AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

3.免疫組化染色：切片脫蠟至水，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，Bcl-2或Bax鼠抗人單克隆抗體工作液37℃孵育2h，polymer Helper 37℃孵育 30min，poly-HRP anti-MouseIgG 37℃ 孵 育30min，DAB顯色5min，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。Bcl-2和Bax均以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色為陽(yáng)性染色。觀察部位同HE染色。采用Motic medical 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HE染色

正常牙組（A）和淺齲組（B）：未見(jiàn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成，成牙本質(zhì)細(xì)胞體積大、數(shù)量多，排列整齊連續(xù)，呈高柱狀，胞漿豐富，數(shù)量約為15.42（正常牙組）和15.71（淺齲組）。

中齲組（C）：大部分中齲齲損部位下方有修復(fù)性牙本質(zhì)形成，厚度不一，其下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞數(shù)量銳減，約為9.91，呈矮柱狀或立方狀，胞漿較少。

圖1 HE染色，×400

圖2 TUNEL染色，×400

圖3 Bcl-2免疫組化染色，×400

圖4 Bax免疫組化染色，×400

深齲組（D）：齲損部位下方均有較厚修復(fù)性牙本質(zhì)形成，其下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞減少至6.41，單層排列，細(xì)胞呈立方狀或扁平狀，體積小，胞漿少。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析詳見(jiàn)附表1。

二、TUNEL染色

實(shí)驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)附表2。

三、免疫組織化學(xué)染色

表1 成牙本質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目及蛋白表達(dá)情況

表2 凋亡細(xì)胞指數(shù)

蛋白Bcl-2和Bax在牙髓組織中均呈陽(yáng)性表達(dá)，成牙本質(zhì)細(xì)胞層染色較固有牙髓細(xì)胞明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析詳見(jiàn)附表1。

討 論

因牙冠有釉質(zhì)包裹，正常情況下外界的刺激不會(huì)引起牙髓反應(yīng)，所以正常牙無(wú)修復(fù)性牙本質(zhì)形成。偶然存在的細(xì)胞凋亡是維持牙髓細(xì)胞數(shù)目穩(wěn)定的重要方式，這與Mitsiadis[1]等學(xué)者的研究結(jié)果是一致的。成牙本質(zhì)細(xì)胞數(shù)量多，體積大，胞漿豐富，說(shuō)明細(xì)胞狀態(tài)良好，具有較強(qiáng)的防御修復(fù)能力。

淺齲組牙髓與正常牙組無(wú)明顯區(qū)別。推測(cè)牙本質(zhì)尚未暴露，淺齲對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞的影響并不明顯。這與方碧松[2]的研究結(jié)果是一致的。偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞，但分布散在，無(wú)集中趨勢(shì)，考慮為細(xì)胞的正常生理凋亡。成牙本質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)良好，具有較強(qiáng)的防御修復(fù)能力。

中齲組TUNEL染色顯示齲損下方成牙本質(zhì)細(xì)胞的凋亡指數(shù)升高，與Mitsiadis等學(xué)者[3]的研究結(jié)果一致。凋亡增多提示此時(shí)細(xì)菌及內(nèi)毒素可以經(jīng)暴露的牙本質(zhì)小管刺激成牙本質(zhì)細(xì)胞突起，進(jìn)而引起胞體的凋亡。中齲組成牙本質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量因凋亡增多而減少，同時(shí)體積變小，胞漿變少，使得成牙本質(zhì)細(xì)胞的修復(fù)能力下降。所以一旦齲病進(jìn)展到中齲后，就要對(duì)近髓處進(jìn)行護(hù)髓處理，以減少粘接劑及充填材料對(duì)牙髓組織的刺激。

深齲組中，修復(fù)性牙本質(zhì)下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞呈立方狀甚至扁平狀，可能是因?yàn)榇罅康拇碳の镉绊懥搜浪杓?xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化成熟，使細(xì)胞停留于分化的某一階段；也有可能是因?yàn)榧?xì)胞的數(shù)目過(guò)少，相互之間缺乏擠壓，所以彼此平鋪成扁平狀。隨著齲損的加深，剩余牙本質(zhì)不斷變薄，對(duì)外通透性明顯增加，使得牙髓組織對(duì)外界刺激更加敏感，損傷反應(yīng)亦更為嚴(yán)重[4]，深齲組的修復(fù)性牙本質(zhì)較中齲組厚且范圍廣泛。由于細(xì)胞大量凋亡，修復(fù)性牙本質(zhì)下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞數(shù)量很少，而且體積小、胞漿少，修復(fù)防御能力很差。此時(shí)即使去除外界刺激進(jìn)行護(hù)髓充填治療，受損的牙髓也較難恢復(fù)正常[5]。

Bcl-2是最早發(fā)現(xiàn)的抗凋亡基因，可顯著延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命，抑制其發(fā)生凋亡[6，7]；Bax的微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)與Bcl-2極為相似，是Bcl-2活性的主要調(diào)控因子。Bax可以與Bcl-2結(jié)合成異源二聚體發(fā)揮抗凋亡作用，還可以形成同源二聚體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常牙組和淺齲組中Bcl-2、Bax的表達(dá)水平均較低。提示兩蛋白的表達(dá)量處于平衡狀態(tài)或Bcl-2占少許優(yōu)勢(shì)，細(xì)胞凋亡的易感性差，故少有成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡。

中齲組中Bcl-2、Bax的表達(dá)水平均升高，Bax增高幅度較為明顯（Bcl-2/Bax為0.841）；深齲組中，兩蛋白的表達(dá)水平更高，Bax的增高幅度尤為明顯（Bcl-2/Bax為0.776）。其機(jī)理可能是：在齲損刺激強(qiáng)度較大時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Bax基因被大量激活，其調(diào)控表達(dá)的Bax也就明顯增多，使得Bcl-2/Bax比值降低；此時(shí)，為了平衡Bcl-2和Bax的比例，Bcl-2也被激活，其調(diào)控的Bcl-2也相應(yīng)增加。但即使如此，Bcl-2/Bax比值仍舊呈降低趨勢(shì)，使得細(xì)胞凋亡的易感性增加，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，造成成牙本質(zhì)細(xì)胞數(shù)目銳減。這與成牙本質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果和凋亡指數(shù)是一致的。

本研究發(fā)現(xiàn)，Bax在齲病進(jìn)展中變化幅度最明顯，Bcl-2/Bax比值是成牙本質(zhì)細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界刺激的重要調(diào)控因素。