朱艷春 王倩 徐金玲

河南省食品藥品檢驗所，河南 鄭州450008

維生素B屬于水溶性維生素，有調(diào)節(jié)新陳代謝，維持皮膚和肌肉的健康，增進免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等功能，是人體內(nèi)新陳代謝的必需一環(huán)。但我國仍未完善針對此類商品維生素B功效成分檢測的相關(guān)標準，目前國標法測定食品中維生素B采用多種條件分別測定［7-10］。這些方法多數(shù)涉及復雜又費時的前處理，并不適用于基質(zhì)相對簡單的保健食品。文獻中報道同時測定維生素B1、維生素B2、維生素B6和煙酰胺的檢驗方法也很多［1-6］，但在樣品前處理及含量測定方法上與國標方法偏離［7］較大。

本研究對國標方法［7］進行改進，建立一種同時測定維生素B1、維生素B2、維生素B6（鹽酸吡哆醇）和煙酰胺的方法，該方法簡便、快速、準確、靈敏，維生素B1、維生素B2、維生素B6測定結(jié)果與其他國標法相比較，誤差較小。煙酰胺仍采用國標方法，但由于在檢測保健食品時常需要同時檢測維生素B和煙酰胺成分，所以在本方法中一并提出同時測定。

1 儀器與試劑

1.1 儀器Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司DAD檢測器）；Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司FLD檢測器）；KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波（昆山市超聲儀器有限公司）；METTLER TOLEDO XPE205電子天平（瑞士梅特勒-托利多集團）。

1.2 試藥 達爾斯康牌B族維生素片（山東圣海保健品有限公司，批號BS201900012）；MCKIN麥金利RB族維生素片（武漢麥鑫利藥業(yè)有限公司，批號BS2019000 18）；艾申特牌B族維生素片（東莞市健林醫(yī)藥科技有限公司，批號為BS201900032）。

維生素B1（硫胺素，純度：97.9%，中國食品藥品檢定研究院，批號：100390-201806）；維生素B2（核黃素，純度：98.2%，中國食品藥品檢定研究院，批號：100369-201504）；維生素B6（鹽酸吡哆醇，純度：99.5%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批號：G154414）；煙酰胺（純度：99.9%，中國食品藥品檢定研究院，批號：100115-201604）。乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；檢測器：二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）；流動相：0.005mol/L 1-癸烷磺酸鈉0.1%磷酸：乙腈=73：27等度洗脫；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：260nm、280nm；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備 對照品溶液的配制：取維生素B1、維生素B2、維生素B6（鹽酸吡哆醇）和煙酰胺對照品適量，精密稱定，分別置于10mL、10mL、10mL、5mL容量瓶中，除維生素B2用1∶1鹽酸溶解后，其余均用水定容至刻度，配制成維生素B1、維生素B2、維生素B6和煙酰胺濃度為1.04mg/mL、1.07mg/mL、1.07mg/mL、2.18mg/mL的對照品儲備液。分別吸取維生素B1、維生素B2、維生素B6和煙酰胺對照品儲備液0.3mL、0.2mL、0.2mL、0.4mL置于10mL容量瓶中，用20%甲醇0.1%磷酸水溶液定容至刻度，配制成混合對照品工作溶液。

2.3供試品溶液的配制 取試樣10片，研細，混合均勻，取達爾斯康牌B族維生素片1.0g；MCKIN麥金利B族維生素片0.5g；艾申特牌B族維生素片0.1g；精密稱定。分別置于50mL容量瓶中，加入20%甲醇0.1%磷酸水溶液約40mL，超聲提取10min，用20%甲醇0.1%磷酸水溶液定容至刻度，待用。

2.4 方法學考察

2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗。取2.2項下對照品工作溶液、供試品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，見圖1、圖2。理論塔板數(shù)以維生素B1、維生素B2、維生素B6和煙酰胺計均大于5000，分離度均大于1.5，基線分離良好。

2.4.2 線性關(guān)系試驗。分別取維生素B1、維生素B2、維生素B6和煙酰胺對照品儲備液各適量，用20%甲醇0.1%磷酸水稀釋制備成系列混合標準工作溶液，取10μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標（X，mg/L），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得維生素B1、維生素B2、維生素B6和煙酰胺的回歸方程分別為：Y1=20.499X1-21.831，Y2=38.698 X2+3.6367，Y3=16.52X3-1.8424，Y4=1.6904X4+2.735（r＞0.9990）。結(jié)果表明，維生素B1、維生素B2、維生素B6和煙酰胺質(zhì)量濃度在10.4～62.6mg/L、5.2～41.7mg/L、5.4～6 4.4mg/L、54.5～152.6mg/L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度試驗。取2.2項下混合對照品溶液適量，按擬定色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示維生素B1、維生素B2、維生素B6和煙酰胺保留時間穩(wěn)定，峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為：0.09%，0.05%，0.11%，0.10%（n=6），表明儀器精密度好。

2.4.4 檢出限試驗。取混合對照品溶液逐級稀釋，得維生素B1檢出限：0.51mg/L、維生素B2檢出限：0.051mg/L、維生素B6檢出限：0.26mg/L和煙酰胺檢出限：0.006mg/L。

2.4.5 加標回收試驗。精密稱取空白樣品9份，分成3組，每組3份樣品，置于25mL容量瓶中，按高、中、低三個濃度分別添加對照品后，照2.2項下方法制備供試品溶液，再按擬定色譜條件進行測定，記錄峰面積，并計算回收率。見表1。

2.4.6 樣品含量測定。取3批樣品各適量，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液再按擬定色譜條件進樣測定，計算樣品含量。對同樣3批樣品進行規(guī)定國標方法檢測，計算樣品含量，與本方法所得樣品含量比較，結(jié)果相近。見表2。

圖1 對照品色譜圖

圖2 樣品色譜峰

表1 加標回收率試驗結(jié)果

續(xù)表1

3 討論

本試驗著力建立一種能同時測定維生素B1、維生素B2、維生素B6和煙酰胺的簡便有效方法，結(jié)合國標方法［7］，對提取溶劑（水、0.1%磷酸水、20%甲醇0.1%磷酸水）進行了考察，結(jié)果確定最優(yōu)的提取溶劑為20%甲醇0.1%磷酸水。對流動相（十二烷基硫酸鈉0.1%磷酸、癸烷磺酸鈉0.1%磷酸、庚烷磺酸鈉0.1%磷酸）等進行了預實驗，結(jié)果各洗脫系統(tǒng)對峰形的影響均不大，但是考慮到色譜柱平衡穩(wěn)定時間以及國標方法［7］前處理過程的一致性，故選擇癸烷磺酸鈉0.1%磷酸作為流動相。參考國標方法［7］的檢測波長，分別在280nm和260nm處進行檢驗，結(jié)果顯示260nm檢測波長下測定維生素B1、維生素B2和煙酰胺，280nm檢測波長下測定維生素B6響應最好。三個樣品的檢測結(jié)果分別與國標方法［7-10］的檢驗結(jié)果比較，其相對標準偏差均在允許范圍內(nèi)。本試驗方法與國標方法［7］比較，用二極管陣列檢測器比紫外檢測器能更好地選擇波長；多組分在同等條件下采用250nm的C18色譜柱比150nm的C18柱分離效果會更好，但出峰時間會推后，因此將柱溫由室溫調(diào)到35℃縮短出峰時間。均能滿足一般含量檢測要求。

表2 樣品含量測定結(jié)果含量與比較表

在改進后的條件下，維生素B1、維生素B2、維生素B6和煙酰胺能有效分離，線性、精密度、穩(wěn)定性、回收率及結(jié)果比較等試驗表明，本方法具有較高的可行性。為以后保健食品中B類維生素和煙酰胺的測定提供試驗支持。