張虹艷,邱國玉,石曉峰，2*，王行智，王小喬，許曉輝,李晨曦,潘秀麗

(1.蘭州市食品藥品檢驗所,甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅 蘭州 730050)

保健食品，是指具有特定保健功能或能補(bǔ)充維生素、礦物質(zhì)的食品，適宜于特定人群食用，不以治療疾病為目的，不對人體產(chǎn)生任何急性、亞急性或慢性危害[1]。不法商販為了達(dá)到其宣稱的保健功效，而在保健食品中非法添加化學(xué)藥物，不可避免地會危害人體健康。近年來出現(xiàn)了許多增強(qiáng)體力、改善生長發(fā)育類的保健食品，除了添加以西地那非為代表的磷酸二酯酶5抑制劑以外，添加雄性激素類藥物的情況也時有發(fā)生。雄性激素主要指由性腺(睪丸)合成的一類內(nèi)分泌激素,消費(fèi)者在不知情的情況下長期不合理地攝入雄性激素會引起內(nèi)分泌失調(diào)、新陳代謝紊亂，以及增加罹患癌癥的風(fēng)險[2-3]。

目前我國發(fā)布的相關(guān)檢驗標(biāo)準(zhǔn)多為補(bǔ)充檢驗方法，檢測對象包括改善睡眠類、降血糖類、降血脂類、降血壓類、減肥類、緩解體力疲勞類等非法添加物，有關(guān)雄性激素類非法添加物的檢測鮮有報道，且缺乏保健食品中雄性激素類非法添加物的檢測標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)外報道的食品中性激素類非食用添加物的檢測方法主要有氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法[4-5]、液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法[6-13]、高效液相色譜法[14-16]，但上述方法均存在分辨率低、驗證手段少和定性分析不準(zhǔn)確的問題。高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF MS)法可對化合物的結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律加以確證,大幅提高定性篩查能力，動態(tài)擴(kuò)充篩查范圍，提前發(fā)現(xiàn)潛在風(fēng)險，被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于非法添加物檢測領(lǐng)域。

本研究基于高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法，建立了固體基質(zhì)、液體基質(zhì)和油性基質(zhì)保健食品中10種雄性激素類非法添加物的快速篩查技術(shù)，可為完善國家標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù),同時為打擊保健食品行業(yè)非法添加行為、規(guī)范保健食品市場提供有力的技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290-6545高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)；5810R冷凍離心機(jī)(德國艾本德公司)；VORTEX KB-3渦旋振蕩器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)；MS105DU電子天平(美國梅特勒公司)，Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：丙酸諾龍(純度98.6%，下同)、諾龍(96.7%)、去氫睪酮(98.8%)、氟甲睪酮(98.0%)、表睪酮(98.0%)購于德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲睪酮(99.5%)、美雄諾龍(99.9%)、苯丙酸諾龍(99.1%)、丙酸睪酮(99.8%)、睪酮(96.6%)購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈、正己烷(色譜純，默克公司)。固體基質(zhì)、液體基質(zhì)和油性基質(zhì)分別選取具有代表性的片劑、口服液、軟膠囊劑為研究對象，實際檢驗樣品均隨機(jī)購于蘭州市藥店、成人用品店，于陰涼處存放。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)品儲備液：準(zhǔn)確稱取10種雄性激素標(biāo)準(zhǔn)品各10.00 mg，分別用乙腈溶解并定容于10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為 1.0 mg/mL的各標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，于 4 ℃冰箱中保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別精密移取各標(biāo)準(zhǔn)品儲備液0.1 mL 置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃冰箱中保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1 固體、液體基質(zhì)稱取固體基質(zhì)、液體基質(zhì)的樣品各0.5 g，置于10 mL離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL乙腈，渦旋振蕩5 min后，于40 ℃水浴超聲10 min，以4 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.2 油性基質(zhì)稱取油性基質(zhì)的樣品0.5 g，按上述方法操作，所得上清液置于10 mL離心管中，加入5 mL乙腈飽和正己烷溶液，渦旋振蕩1 min，靜置分層，棄去上層正己烷溶液，下層溶液過0.22 μm濾膜，待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(3.0 mm×150 mm,1.8 μm)；流動相：A為0.1%甲酸溶液(含10 mmol/L乙酸銨)，B為0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫：0～2.0 min，20% B；2.0～4.0 min，20%～35%B；4.0～6.0 min，35%～40% B；6.0～12.0 min，40%～70% B；12.0～14.5 min，70%～85%B；14.5～17 min,85% B;17～18 min，85%～20% B；18～20 min，20% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件離子源:電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；干燥氣溫度：320 ℃；干燥氣流速：8 L/min；霧化氣壓力：241 kPa；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：11 L/min；毛細(xì)管電壓：3 500 V；全掃描范圍：m/z50～1 000；參比離子：m/z121.050 9和922.009 8(用于實時校正)，碰撞能量：20 eV。

1.4.3 質(zhì)譜庫的建立按上述儀器條件，在全掃描模式(MS mode)下對質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL的10種待測藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，獲得化合物的精確相對分子質(zhì)量、同位素信息和保留時間，建立一級譜庫。然后在HPLC-Q-TOF MS的MS/MS模式(Targeted MS/MS mode)下分析，得到不同碰撞能量(10、20、30、40 eV)下碎片離子的質(zhì)譜圖，建立二級譜庫。最后將兩次數(shù)據(jù)采集的化合物精確相對分子質(zhì)量、保留時間和碎片離子的質(zhì)譜圖導(dǎo)入PCDL軟件，完成質(zhì)譜庫的建立。10種雄性激素的分子式、分子離子理論質(zhì)荷比、分子離子實際質(zhì)荷比、產(chǎn)物離子、碰撞能量(CE)等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 10種雄性激素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of the 10 androgen drugs

圖1 2種前處理方法的平均回收率Fig.1 Average recoveries of two sample preparation methods

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

選取具有代表性的片劑、口服液、軟膠囊劑，對比了超聲提取法、液液萃取(LLE)法2種前處理方法的適用性。片劑研磨均勻后取樣，口服液直接取樣，軟膠囊劑取其內(nèi)容物，精密移取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL至以上3種樣品的空白基質(zhì)中，按“1.3”進(jìn)行超聲處理和液液萃取。

在2種不同前處理條件下，10種雄性激素的回收率如圖1所示。結(jié)果顯示，固體基質(zhì)和液體基質(zhì)使用超聲提取法和液液萃取法的回收率均較高，且超聲法操作簡便，基本無損失。油性基質(zhì)使用超聲提取法的回收率較差，推測是由于油脂未除去導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)，因此用正己烷液液萃取將油脂除去，回收率得到很大提升。綜上，固體基質(zhì)和液體基質(zhì)前處理選擇超聲提取法，油性基質(zhì)選擇液液萃取法。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)評價

將質(zhì)量濃度均為100 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣3針，采用下式評價基質(zhì)效應(yīng)(ME)：ME=基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均響應(yīng)值/溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均響應(yīng)值。ME=1.0表示不存在基質(zhì)效應(yīng)，0.81.5為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[17]。使用超聲提取法和液液萃取法分別進(jìn)行樣品前處理，考察液體、固體、油性3種不同基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，采用超聲法，液體基質(zhì)和固體基質(zhì)中待測物均為弱基質(zhì)效應(yīng)(ME為0.80～1.10)；油性基質(zhì)中諾龍、去氫睪酮和丙酸睪酮為弱基質(zhì)效應(yīng)(ME分別為0.83、1.07、0.81)，氟甲睪酮為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)(ME=0.46)，其余6種待測物為中等基質(zhì)效應(yīng)(ME為0.54～0.76)。采用液液萃取法，液體基質(zhì)和固體基質(zhì)中待測物均為弱基質(zhì)效應(yīng)(ME為0.81～1.08),油性基質(zhì)中待測物均呈弱基質(zhì)效應(yīng)(ME為0.80～1.06)。證明超聲提取法適用于液體基質(zhì)和固體基質(zhì)，液液萃取法更適用于油性基質(zhì)中待測物的提取。

圖2 10種雄性激素的TOF MS篩查流程Fig.2 Screening process of 10 androgen drugs by TOF MS

2.3 快速篩查方法的建立

圖3 諾龍、苯丙酸諾龍和未知化合物的二級質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS spectra of nandrolone,nandrolone phenylpropionate and unknown compound

圖4 丙酸諾龍的裂解路徑Fig.4 The fragment patterns of nandrolone 17-propionate

因此，通過丙酸諾龍對照品建立其一級以及二級譜庫，將樣品按本方法進(jìn)行前處理后，進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描，與PCDL軟件中已建立的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行自動檢索，通過精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、同位素分布和同位素比例4個指標(biāo)進(jìn)行匹配度打分，匹配度為90.3分。再對篩查出的丙酸諾龍可疑化合物進(jìn)行二級質(zhì)譜匹配，給予分子離子峰一定能量，通過碎片離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)和豐度比進(jìn)行確認(rèn)，將PCDL二級數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入定性分析軟件，進(jìn)行匹配度打分，碎片離子與二級數(shù)據(jù)庫匹配良好，檢索得分為92.9，因此確證該可疑化合物為丙酸諾龍，同時將其信息添加到初期建立的譜庫中。

使用建立的非法添加物譜庫對未知物進(jìn)行篩查，可通過與已建立譜庫中的化合物二級質(zhì)譜對比，推斷出可能的未知化合物，并將此未知化合物進(jìn)行確認(rèn)后擴(kuò)充到已建立的譜庫中，不斷更新譜庫對未知物的篩查能力。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 專屬性取空白的固體基質(zhì)、液體基質(zhì)、油性基質(zhì)保健食品按“1.3”進(jìn)行樣品前處理，再按“1.4”條件進(jìn)行測定，結(jié)果均未檢出待測10種雄性激素，表明空白基質(zhì)對檢測無干擾。

2.4.2 線性范圍、檢出限與定量下限精密移取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，配制成質(zhì)量濃度分別為2、10、20、50、100、200、500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，以各化合物的質(zhì)量濃度(X，ng/mL)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,10種雄性激素在2～500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999。將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白基質(zhì)中，加標(biāo)濃度逐級遞減，按“1.3”進(jìn)行樣品前處理，以3倍信噪比時計算檢出限(LOD)，10倍信噪比時計算定量下限(LOQ)。固體基質(zhì)、液體基質(zhì)和油性基質(zhì)中的檢出限為0.01～0.06 mg/kg，定量下限為0.03～0.2 mg/kg(見表2)。

表2 10種雄性激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients,LODs and LOQs of the 10 androgen drugs

2.4.3 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在片劑、口服液、軟膠囊劑的空白基質(zhì)中加入低、中、高3個不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度平行測定6次，加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，10種雄性激素的平均回收率為74.3%～113%，RSD為1.2%～7.7%。

表3 10種雄性激素在3種保健食品基質(zhì)中的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of the 10 androgen drugs in three kinds of health food matrices

2.5 實際樣品檢測

應(yīng)用本方法檢測50批次市售保健食品，按上述方法進(jìn)行快速篩查，發(fā)現(xiàn)1批次樣品含有可疑未知化合物，利用碎片離子進(jìn)行質(zhì)譜裂解路徑的推斷，確認(rèn)該非法添加物為丙酸諾龍，含量為0.13 mg/kg，其色譜圖及質(zhì)譜圖如圖5所示。丙酸諾龍的檢出量較低，推測該化合物與其他增強(qiáng)體力、改善生長發(fā)育類藥物可通過協(xié)同作用以增強(qiáng)藥效，減小藥物用量。

圖5 陽性樣品的色譜圖和質(zhì)譜圖Fig.5 Chromatogram and mass spectra of a positive sampleA.TIC；B.MS spectrum；C.MS/MS spectrum

3 結(jié) 論

本研究針對3種具有代表性的保健食品基質(zhì)，對比了2種前處理方法，通過自行構(gòu)建的高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜的一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫和二級譜庫，建立了快速篩查10種雄性激素的檢測方法。該方法操作快速、靈敏、準(zhǔn)確，可及時有效地發(fā)現(xiàn)保健食品市場中非法添加行為，打擊虛假宣傳行為，降低保健食品安全風(fēng)險，為行政監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持。