易珊珊， 杜鑫

(南充農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，四川 南充 637000)

真菌毒素是真菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的次生代謝有毒產(chǎn)物，不易被烹調(diào)加熱或加工破壞，具有生殖毒性、腎毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性等多種危害，對(duì)人和動(dòng)物均可造成嚴(yán)重?fù)p害[1-3].據(jù)相關(guān)報(bào)道[4-6]，每年約有25%的小麥、玉米、高粱和大米等糧食在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸和貯存過(guò)程中，因發(fā)生霉變而產(chǎn)生有毒有害的真菌毒素,主要有嘔吐毒素(deoxynivalenol，DON)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)和黃曲霉毒素B1(aflatoxins，AFTB1)等.

目前，常用膠體金免疫層析法[7]、酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒法[8]、免疫親和柱-高效液相色譜法[9-13]及同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[9-16]等檢測(cè)真菌毒素.膠體金免疫層析技術(shù)和酶聯(lián)免疫法主要用于快速篩選真菌毒素，屬于半定量分析，且易受到基質(zhì)干擾而定量不準(zhǔn).免疫親和柱-高效液相色譜法具有選擇性強(qiáng)及靈敏度較高等特點(diǎn)，但是只能測(cè)單一種類(lèi)的真菌毒素，存在成本較高、試劑損耗大、耗時(shí)長(zhǎng)和環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)，不適用于同時(shí)檢測(cè)復(fù)雜樣品基質(zhì)中的多種真菌毒素殘留.同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法常用多功能(免疫)凈化柱或固相萃取柱來(lái)凈化樣品提取液，在提取樣品前加入了全碳標(biāo)記的穩(wěn)定同位素毒素內(nèi)標(biāo)來(lái)消除基質(zhì)效應(yīng)，但是穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)價(jià)格昂貴，不易購(gòu)買(mǎi)，導(dǎo)致試驗(yàn)成本很高.

因此，基于前期的液質(zhì)串聯(lián)檢測(cè)技術(shù)[18-19]，研究建立了PRIME-HLB固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)快速檢測(cè)糧食中4種真菌毒素含量的方法，以期進(jìn)一步提高檢測(cè)效率，縮短分析時(shí)間，減少試劑損耗，并及時(shí)發(fā)現(xiàn)不合格樣品，為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液DON (100.00 μg/mL，GBW(E)100304)、OTA (2.00 μg/mL，GBW(E)100303)、ZEN (20.00 μg/mL，GBW(E)100301)和AFTB1(2.00 μg/mL，GBW(E)100302)均購(gòu)于國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，并用純甲醇稀釋配制成真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液，保存于4 ℃冰箱.Oasis PRIME-HLB小柱(6cc/500 mg，貨號(hào)186008718,美國(guó)Waters公司)；甲醇、乙腈、正己烷、氨水及甲酸均為色譜級(jí)(美國(guó)Fisher公司).

Acquity H-Class型超高效液相色譜儀和Xevo TQ-S型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)，HS501型振蕩搖床(德國(guó)IKA公司)，Vortex Genius 3型旋渦混合器(德國(guó)IKA公司)，3-18KS型高速冷凍離心機(jī)(Sigma(德國(guó))公司)，ML802型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)，N-EVAP112型氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)，Milli-Q型超純水儀(美國(guó)Millipore公司)，離心管(康寧(上海)有限公司)，PTFE0.22 μm針孔式微孔濾膜(天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司).

1.2 樣品提取

糧食樣品經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎混合均勻后過(guò)20目篩，稱(chēng)取5 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入25.00 mL乙腈-水(體積比84∶16)提取液，渦旋混勻，置于搖床中振蕩提取20 min，高速離心機(jī)10 000 r/min離心5 min，吸取上清液10 mL至50 mL離心管，加入10 mL乙腈飽和的正己烷除脂，高速冷凍離心5 min，吸取6 mL下層清液待凈化.

1.3 樣品凈化

將待凈化液直接通過(guò)PRIME-HLB固相萃取柱，收集濾液于15 mL離心管中，收集全部流出液，準(zhǔn)確移取5.00 mL用氮?dú)?45℃)吹至近干，再加入1.00 mL甲醇-水(體積比3∶7)混合溶液定容，渦旋混勻后過(guò)0.22 μm微孔濾膜，待上機(jī)檢測(cè).

1.4 儀器檢測(cè)條件

色譜條件：Waters XBridge C18色譜柱(50 mm×3.0 mm,3.5 μm)，柱溫40 ℃，樣品室溫度16 ℃，進(jìn)樣量2.00 μL；流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)0.05%甲酸甲醇(A)+體積分?jǐn)?shù)0.1%氨水溶液(B)+乙腈(C)；梯度洗脫程序詳見(jiàn)表1.

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源的毛細(xì)管電壓3.0 kV，以高純氮?dú)鉃槊撊軇夂湾F孔氣，脫溶劑氣溫度和流量為500 ℃和1 000 L/h，錐孔氣流量為150 L/h，碰撞氣為高純氬氣，其流量為0.10 mL/min.采用電噴霧正離子模式(Positive electrospray ionization,ESI+)、負(fù)離子模式(Negative electrospray ionization,ESI-)并選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple reaction monitoring,MRM)方式采集數(shù)據(jù).利用儀器“Intellistart”功能快速優(yōu)化出的儀器參數(shù)見(jiàn)表2.

表1 超高效液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序

表2 4種真菌毒素的儀器檢測(cè)參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相優(yōu)化

在ESI+和ESI-電離模式下，試驗(yàn)初步選取甲醇(A相)、水(B相)和乙腈(C相)為流動(dòng)相，向甲醇中加入少量甲酸，水相中加入少量氨水，對(duì)4種真菌毒素在不同流動(dòng)相體系下進(jìn)行了全掃描，分析響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度，同時(shí)進(jìn)試樣觀察目標(biāo)物的保留時(shí)間、峰形和響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度，優(yōu)化后流動(dòng)相體系見(jiàn)表1，所得的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1.研究發(fā)現(xiàn)，采用甲醇-乙腈-水體系，加入少量甲酸和氨水后，不僅提高了目標(biāo)物的離子化效率，而且有效改善了目標(biāo)物的峰形，從而增強(qiáng)響應(yīng)信號(hào).

DON為嘔吐毒素，OTA為赭曲霉毒素A，AFT B1為黃曲霉毒素B1，ZEN為玉米赤霉烯酮.

2.2 提取液優(yōu)化

據(jù)文獻(xiàn)[9-16]，真菌毒素的提取劑主要有甲醇-水和乙腈-水體系，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用混合液乙腈-水(體積比84∶16)和甲醇-水(體積比84∶16)為提取液時(shí)，4種真菌毒素的回收率均較好，鑒于乙腈-水體系沉淀糧食試樣中蛋白質(zhì)的效果優(yōu)于甲醇-水，最終確定為乙腈-水(體積比84∶16)混合液為提取劑.

2.3 凈化小柱優(yōu)化

目前，固相萃取法是廣泛使用的樣品凈化處理技術(shù)，根據(jù)凈化原理分為目標(biāo)物吸附型和雜質(zhì)吸附型[17].為進(jìn)一步去除提取液中脂肪、色素及蛋白質(zhì)等干擾雜質(zhì)，試驗(yàn)采用不同凈化原理的固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行前處理，主要考察了免疫親和柱、多功能凈化柱、C18小柱、HLB柱及PRIME-HLB柱，研究其對(duì)不同基質(zhì)中的4種真菌毒素提取液的凈化效果、基質(zhì)效應(yīng)及回收率的影響.

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：多殘留免疫親和柱凈化提取液過(guò)程耗時(shí)很長(zhǎng)，且價(jià)格比較昂貴；多功能凈化柱凈化含油量高和色素深的高粱樣品時(shí)，凈化后的樣品中仍含有較多懸濁物，凈化不徹底，對(duì)儀器污染損害較大，且加標(biāo)回收率約為50%；采用傳統(tǒng)的反相固相萃取柱C18小柱和HLB柱凈化樣品時(shí)，耗時(shí)較長(zhǎng)，4種真菌毒素回收率整體偏低，可能是由于這類(lèi)小柱原理是吸附提取液中目標(biāo)物，將雜質(zhì)進(jìn)行淋洗除去，但并非對(duì)特定毒素具有專(zhuān)一吸附性，在目標(biāo)物吸附和雜質(zhì)淋洗過(guò)程中，導(dǎo)致目標(biāo)物損失.

Oasis PRIME-HLB是一種新型的反相固相萃取(SPE)小柱，不需要平衡活化可直接上樣，屬于過(guò)濾性去除雜質(zhì)的固相小柱，極大簡(jiǎn)化和加速了SPE流程.比較未使用 PRIME-HLB柱凈化和使用 PRIME-HLB 凈化后的空白基質(zhì)的響應(yīng)信號(hào)，發(fā)現(xiàn)凈化后的空白基質(zhì)溶液更干凈，上機(jī)背景響應(yīng)信號(hào)也更低，表明PRIME-HLB能有效去除大部分磷脂、鹽和蛋白等大部分基質(zhì)干擾物，不僅基質(zhì)效應(yīng)更小，而且前處理過(guò)程更加高效快捷.

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢出限

為補(bǔ)償不同試樣中某些基質(zhì)對(duì)離子源電噴霧離子化效率及目標(biāo)物離子信號(hào)強(qiáng)度抑制或增強(qiáng)效應(yīng)，提高方法的選擇性和準(zhǔn)確性，配制混合空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng).將真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用小麥、玉米、大米和高粱試樣的空白基質(zhì)混合溶液稀釋成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按儀器檢測(cè)條件進(jìn)行檢測(cè)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r為0.997 8～0.999 2， 線(xiàn)性良好.在目標(biāo)物最低質(zhì)量濃度附近添加一系列已知濃度的雙份樣品，測(cè)定其響應(yīng)信號(hào)，用Masslynx V4.1軟件計(jì)算信噪比(Signal-to-noise ratio,S/N)，方法檢出限(Limit of detection,LOD)取S/N=3，方法定量限(The limits of quantification,LOQ)取S/N=10，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 4種真菌毒素檢測(cè)的線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)、定量限和檢出限

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

選取篩選后的小麥、玉米、大米和高粱等空白樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn).為模擬實(shí)樣測(cè)定過(guò)程，試樣加入真菌毒素標(biāo)液后，輕微振蕩離心管，密封避光過(guò)夜，讓試樣充分吸收毒素后，次日按照1.2-1.4節(jié)條件進(jìn)行樣品提取、凈化及上機(jī)檢測(cè).以測(cè)定含量的平均值與參照值的百分比(回收率)來(lái)表示準(zhǔn)確度.每個(gè)試樣做6 個(gè)平行質(zhì)控樣品，以實(shí)測(cè)含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation,RSD)表示精密度.由表4可以看出，小麥、玉米、大米和高粱等樣品的低、中、高3個(gè)水平的加標(biāo)試驗(yàn)回收率均介于75.5%～98.6%，RSD不大于6.6%，符合食品理化檢測(cè)的要求[20]，表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿(mǎn)足實(shí)樣檢測(cè)需求.

表4 方法回收率和精密度測(cè)定結(jié)果

2.6 實(shí)樣檢測(cè)

選取某地送檢的疑似真菌毒素超標(biāo)樣品進(jìn)行了復(fù)核，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，結(jié)果見(jiàn)表5.查判定標(biāo)準(zhǔn)[21]，判定小麥中ZEN超標(biāo)，玉米中ZEN和AFTB1均超標(biāo)，高粱中OTA超標(biāo)，大米(粳米)中僅檢出了少量AFTB1，但未超標(biāo).

表5 糧食中4種真菌毒素含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié) 語(yǔ)

基于PRIME-HLB固相萃取凈化技術(shù)，試驗(yàn)建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速同時(shí)測(cè)定糧食中DON、OTA、ZEN和AFTB1等4種真菌毒素含量的方法，該方法具有檢出限低、穩(wěn)定性好、回收率高且速度快等優(yōu)點(diǎn).利用該方法對(duì)小麥、玉米、大米和高粱等樣品中的真菌毒素進(jìn)行測(cè)定，耗時(shí)少，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可為糧食及其制品中多種真菌毒素的檢測(cè)和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐.