李玉靜，劉鵬茹，劉靜靜，李春生

(1.河北交通職業(yè)技術學院，河北 石家莊 050035；2.河北省科學院生物研究所，河北 石家莊 050081)

萬古霉素分子量1485.72，是一種糖肽類抗生素，可用于多種耐藥性葡萄球菌如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引發(fā)的感染，如腦膜炎、感染性心內膜炎、骨髓炎、肺炎、關節(jié)炎等，及手術、創(chuàng)傷引起的繼發(fā)感染[1,2]。萬古霉素對多重耐藥G+菌敏感性高，但其副作用也比較明顯，如耳腎毒性、紅人綜合征等[3,4]。有研究結果顯示，萬古霉素耳腎毒性的發(fā)生與其血藥濃度有關，當達到20μg/mL以上時，出現(xiàn)不良反應的概率升高[5,6]。萬古霉素的給藥劑量與血藥濃度，在腎功能正常的成年人中存在良好的線性關系，但在兒科群體中還不能肯定[7,8]。因其安全濃度范圍窄、個體用藥差別大、且有副作用，在使用萬古霉素治療時，有必要進行血藥濃度監(jiān)測(TDM)[1,9]，以提高治療效果并減少不良反應。

萬古霉素血藥濃度的測定，目前多采用色譜法和免疫學方法[10,11]。液質聯(lián)用(HPLC-MS/MS)檢測限低、結果可靠，但是其操作繁瑣、耗時長[12]。免疫學方法主要是化學發(fā)光微粒子免疫檢測法(CMIA)，具有特異性好、操作簡單等特點，適于快速檢測[13]。本研究合成了萬古霉素的人工抗原并進行鑒定，為萬古霉素的免疫學方法研究制備了原料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

萬古霉素(vancomycin,VCM)，中國食品藥品檢定研究院；弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑，牛血清白蛋白(BSA)，雞卵清白蛋白(OVA)，三羥甲基氨基甲烷(Tris) ，丙烯酰胺(Acr) ，亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)，均購自Sigma；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(二抗)，北京中杉金橋；四甲基乙二胺(TEMED)，美國BBI公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器

移液器，ND2000超微量核酸蛋白測定儀，德國Thermo；酶標儀，美國Bio-TEK；90-2型磁力攪拌器，上海浦江分析儀器廠；微量震蕩器，金業(yè)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 萬古霉素半抗原的制備

稱取萬古霉素25 mg、琥珀酸酐20 mg，用二甲基亞砜0.6 mL 溶解，加入吡啶0.2 mL，80℃攪拌反應4h，37℃烘干，固體為半抗原。

1.3.2 免疫原的制備

取20 mg半抗原，溶于2 mL N,N-二甲基甲酰胺中，取碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺各30 mg，用0.2 mL 0.01 M的PBS溶解后加入半抗原溶液中，室溫攪拌24h，得到反應液Ⅰ。稱取牛血清白蛋白50 mg，溶解在3 mL 0.01M的PBS中，然后滴加入反應液Ⅰ中，室溫攪拌24h，用0.01 M的PBS 4℃透析3d，分裝，-20℃保存。得到免疫原VCM-BSA。

1.3.3 包被原的制備

用卵清白蛋白40mg代替牛血清白蛋白，其他步驟同1.2.2。得到包被原VCM-OVA。

1.3.4 人工抗原的鑒定

(1)紫外分光光度法鑒定。用PBS稀釋VCM、VCM-BSA、BSA至相同濃度，進行紫外全波長(220～700 nm)掃描，計算BSA與萬古霉素的分子偶聯(lián)比[14]。

(2)SDS-PAGE鑒定。按照常規(guī)SDS-PAGE方法，配制12%分離膠，5%濃縮膠，電壓30V至蛋白條帶進入分離膠后，調節(jié)電壓90V繼續(xù)電泳約2h。經染色、脫色處理后拍照。

(3)動物免疫。取3只5周齡的Balb/c小鼠，背部皮下多點注射，免疫劑量VCM-BSA 40μg/只，每隔2周免疫一次，共4次。4次免疫后7-10天斷尾取血，分別檢測小鼠血清抗體效價和抑制率。

(4)血清效價測定。采用間接ELISA法，具體步驟如下：VCM-OVA濃度為2μg/ml，100μl/孔，4℃包被過夜；洗滌、拍干，加200 μl/孔封閉液(小牛血清:洗滌液=1∶9)，37℃放置1h；洗滌、拍干，待測血清以1∶200、1∶400、1∶800…倍比稀釋，100 μL/孔，設置洗液為空白對照、陰性血清為陰性孔，37℃反應45 min；洗滌、拍干，加入100μl/孔的1∶10000稀釋的二抗，37℃反應30min；洗滌，拍干，加顯色液37℃顯色10 min，終止反應。測定A450nm值。陰性對照孔A450nm值為N，陽性為P，以P/N≧2.1時為抗體效價。

(5)血清敏感性測定結果。采用間接ELISA法測定，步驟同1.3.4中(4)，加待測血清改為加待測血清和標準品：將標準品稀釋成50 μg/L、25 μg/L、12.5 μg/L、6.25 μg/L、3.125 μg/L， 50 μl/孔，再加入稀釋的陽性血清50 μl，50 μl陰性血清+50 μl PBS作為陰性對照，37℃放置45 min。

2 結果分析

2.1 合成抗原蛋白濃度的測定結果

合成的抗原用超微量核酸蛋白測定儀測定，濃度分別為VCM-BSA為4.4 mg/mL，VCM-OVA為12 mg/mL。

2.2 紫外光譜掃描結果

紫外掃描結果顯示，BSA的特征吸收峰在278 nm處，VCM的特征吸收峰在282 nm處，二者合成產物的吸收峰在278～280 nm之間，且峰形與BSA更接近。因此可初步判定免疫原VCM-BSA合成成功。

2.3 SDS-PAGE 鑒定結果

由圖2可以看出，偶聯(lián)產物與BSA有明顯差別，帶寬且有拖尾，初步判定VCM-BSA偶聯(lián)成功。

圖1 VCM-BSA紫外掃描圖譜

1.蛋白marker；2.BSA；3.VCM-BSA圖2 VCM-BSA 凝膠電泳結果

2.4 小鼠抗血清效價測定結果

表1 間接ELISA測定小鼠血清效價

表1為第4次免疫后7d小鼠的血清效價。由表1可知，1號小鼠效價為1∶51200，2號和3號小鼠血清效價較高，均在1∶102400以上，可以判定抗原偶聯(lián)成功。

2.5 小鼠抗血清敏感性測定結果

圖3 小鼠血清敏感性測定結果

用競爭ELISA測定。以B/B0(B代表標準品A450nm，B0代表陰性對照A450nm)為縱坐標，以各標準品的濃度的對數值為橫坐標，繪制標準曲線，并計算半數抑制質量濃度(IC50)，IC50值越低則敏感性越好。圖3所示為免疫小鼠血清敏感性結果，各小鼠的IC50值均在20μg/L以下，血清敏感性較好。

3 總結

本研究先將萬古霉素與琥珀酸酐反應得到半抗原，再用碳二亞胺法將半抗原與載體蛋白偶聯(lián)制備包被原和免疫原，再分別經紫外掃描法、SDS-PAGE電泳和免疫學方法對兩種抗原進行檢測，結果顯示人工抗原的紫外吸收峰位移、及分子量發(fā)生變化，從化學結構的變化初步判定抗原合成成功。免疫小鼠血清檢測結果顯示效價高、敏感性好，從抗原抗體的特異性反應判定抗原合成成功。本研究成功制備了萬古霉素人工抗原，免疫了實驗動物，可以用于后續(xù)制備單克隆抗體，作為免疫學檢測方法研究的實驗原料。