王 濤，韓 蕓，滑鵬敏，張 偉，韓 旭

(河北省產品質量安全檢測技術中心，河北 石家莊 050051)

2002年2月，農業(yè)部發(fā)布了《禁止在飼料和動物飲水中使用的藥物品種目錄》(農業(yè)部公告第176號)，目錄中規(guī)定了禁止在飼料中添加的精神藥品包括苯巴比妥、艾司唑侖、地西泮、鹽酸氯丙嗪等。近年來，一些養(yǎng)殖戶仍然在飼料中添加入這些國家明文禁止使用的鎮(zhèn)靜類藥物，使用這些藥物可以影響動物正常的生理代謝功能，導致動物嗜睡且快速增長，但這些藥物可以在動物體內積蓄，人類吃了這種積蓄了鎮(zhèn)靜類藥物的動物以后，身體健康就會受到一定程度的影響。因此，對飼料中是否含有鎮(zhèn)靜類藥物的檢測顯得尤為重要。

對飼料添加劑的檢測，目前，我國主要采用傳統(tǒng)的溶劑萃取、液液分配、柱層析凈化等技術。采用這些技術進行檢測，不僅自動化程度低，提取凈化效率不高，檢測速度慢，而且由于大量使用有機溶劑導致對環(huán)境的污染比較嚴重的。

經(jīng)過長達5年的研究，我們利用高效毛細管電泳法實現(xiàn)了對苯巴比妥，艾司唑侖、地西泮和鹽酸氯丙嗪等鎮(zhèn)靜類藥物的快速檢測和同時檢測，可以連續(xù)自動進樣及在線分析，能夠應用于大批量樣品的測定，精確度優(yōu)于高效液相色譜法(HPLC法)。而且分離過程所用溶液大多為鹽類的緩沖液，與常用的液相色譜法分離方法比較，減少了有機化學試劑的使用，降低了對實驗室儀器操作人員的危害，同時也減少了對環(huán)境的污染。本實驗分別從緩沖液種類及pH值、表面活性劑SDS的濃度、添加劑、毛細管長度、檢測波長等幾個方面分析，選擇合適的檢測條件，最終獲得了苯巴比妥，艾司唑侖、地西泮和鹽酸氯丙嗪四種物質的高效檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器

毛細管電泳儀、分析天平、旋渦混合器、電動離心沉淀器、超純水機、超聲波清洗器、恒溫水浴鍋等。

1.2 試劑

苯巴比妥、艾司唑侖、地西泮、鹽酸氯丙嗪、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甲醇、乙腈、冰醋酸、正已烷、鹽酸、氫氧化鈉等，均為分析純。

1.3 樣品處理

將飼料磨碎，然后用2.8mm孔篩篩分，稱取磨碎后的飼料2g，放于50ml離心管中，加入乙腈30ml，超聲30min，再以3000轉/min的速度離心5min，取上清液蒸干，用4ml濃度為2%的乙酸溶液溶解，混勻，加入2ml正已烷，渦動30s-60s，取上清液用0.45μm微孔濾膜過濾后蒸干，最后加入PH8.6的磷酸鹽緩沖液定容到1.00ml。

1.4 電泳條件

柱長：37cm，柱溫：25℃，工作電壓：18kV，檢測波長：257nm，緩沖液體系的pH值：8.60[1]。

2 結果與討論

2.1 緩沖液種類及pH值的選擇

緩沖液種類及pH值的選擇，是以待測物的性質以及分離效率為依據(jù)確定的，是分離成敗的關鍵因素之一。緩沖液的pH值直接影響到組分的存在形式、解離程度、質子化程度等,進而決定了組分的淌度和體系的電滲流。pH值的選擇應以待測物的pKa值為依據(jù)[2]。苯巴比妥的pKa值為7.4，艾司唑侖的pKa值為2.84，地西泮的pKa值為3.4，鹽酸氯丙嗪的pKa值為9.3。本實驗選擇了磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液，同時調試不同pH值進行組合實驗測試，經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，當采用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液且pH值為8.6進行測試時，這四種鎮(zhèn)靜類藥物均發(fā)生電離，能夠得到四個峰的電泳圖，且分離效果較好。

2.2 表面活性劑SDS的濃度選擇

SDS，即十二烷基硫酸鈉，是一種陰離子表面活性劑，在電泳技術中應用十分廣泛。表面活性劑濃度對組分的分離度以及遷移時間有著重要的影響。組分的遷移時間隨著 SDS 的濃度增加而增加,根據(jù)多次實驗測試，SDS濃度為15 mmol/L時效果最佳。

2.3 添加劑的選擇

常用添加劑為有機溶劑，一般選用乙睛、甲醇、異丙醇等，濃度一般為5%～20%。加入有機溶劑后,可以使一些較難分離的化合物得到分離，但隨著添加劑濃度的增加，遷移時間會明顯延長。同時，我們又考慮了安全環(huán)保因素，最終選擇了7.5% 的甲醇作為添加劑。

2.4 毛細管長度的選擇

我們分別選擇了27cm、37cm、47cm、57 cm 的毛細管進樣, 測試發(fā)現(xiàn)，測試發(fā)現(xiàn)，隨著毛細管長度的增加,分離時間相應增加,電流相應減少。因此，我們選擇了37cm的毛細管。

2.5 檢測波長的選擇

我們選擇了220nm、240nm、257nm、268nm、284nm等不同的波長進行測試，測試發(fā)現(xiàn)，當波長為257nm時，苯巴比妥、艾司唑侖、地西泮、鹽酸氯丙嗪這四種鎮(zhèn)靜類藥物均有很高的紫外吸收，且有較好的靈敏度，因此，我們選擇257nm作為檢測波長。

2.6 線性關系和檢測限

配制系列濃度的四種鎮(zhèn)靜劑類藥物的標準溶液，在選定的最佳電泳條件下進行對照實驗、線性關系和檢測限的實驗，驗證了方法的準確性、可靠性，能夠滿足飼料類產品中鎮(zhèn)靜劑類藥物的檢測要求，檢測結果見表1。從表1可以看出，苯巴比妥、艾司唑侖、鹽酸氯丙嗪的線性范圍均為5～50μg/ml，地西泮的線性范圍為10～50μg/ml，線性相關系數(shù)≥0.9479。苯巴比妥、艾司唑侖、鹽酸氯丙嗪的檢測限為2mg/kg，地西泮的檢測限為5mg/kg。

表1 線性關系和檢測限(n=6)

2.7 樣品檢測

將飼料樣品按照上述條件進行樣品處理和檢測，檢測結果見表2。

表2 各組分濃度與峰面積關系

出峰順序分別為：t苯巴比妥=3.54min；t艾司唑侖=7.31min；t地西泮=8.17min；t鹽酸氯丙嗪=10.04min。

2.8 方法的回收率及精密度實驗

對飼料樣品進行不同濃度水平的加標回收率及精密度試驗，測定結果見表 3。從表3可以看出，被測樣品回收率為 67.5%～98.2%，精密度為5.7%～12.3%。

表3 回收率及精密度試驗(n=6)

3 小結

本實驗在弱堿性條件下同時快速檢測飼料中苯巴比妥、艾司唑侖、地西泮、鹽酸氯丙嗪四種鎮(zhèn)靜類藥物，在11min內可以實現(xiàn)分離檢測，苯巴比妥、艾司唑侖、鹽酸氯丙嗪的線性范圍均為5～50μg/ml，地西泮的線性范圍為10～50μg/ml，線性相關系數(shù)≥0.9479。苯巴比妥、艾司唑侖、鹽酸氯丙嗪的檢測限為2mg/kg，地西泮的檢測限為5mg/kg，樣品回收率為67.5%～98.2%，精密度為5.7%～12.3%。

將高效毛細管電泳法用于飼料中鎮(zhèn)靜類藥物的檢測，為飼料產品質量安全檢測提供了快速、高效的檢測方法，有利于提高飼料產品的安全性，對促進飼料行業(yè)的健康發(fā)展，保障畜牧類產品質量安全，維護公眾健康，促進畜牧行業(yè)高質量發(fā)展具有重要意義。