趙維章，張正英

(青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，青海 西寧 810000)

據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)統(tǒng)計(jì)，食源性病原菌中的大腸桿菌和沙門菌成為畜產(chǎn)品污染中常見(jiàn)的食源性致病菌，以沙門菌對(duì)人的危害較大[1]。沙門菌呈世界性流行，被沙門菌污染的肉、蛋、奶等動(dòng)物源性食品成為感染人類的主要途徑，主要引起人們腹瀉、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重者還會(huì)引起敗血癥，甚至導(dǎo)致死亡，嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全[2]。沙門菌在自然界中具有廣泛的宿主，各種食物包括零售動(dòng)物肉類食品、雞蛋、水果及蔬菜，尤其是禽、豬肉產(chǎn)品，被認(rèn)為是沙門菌傳播和暴發(fā)的載體[3]。相關(guān)研究表明，豬是沙門菌的主要宿主，養(yǎng)豬場(chǎng)、屠宰場(chǎng)和市場(chǎng)是豬源沙門菌發(fā)生污染和傳播的主要場(chǎng)所，人們食用被污染的豬肉或豬肉制品后引發(fā)沙門菌病[4]。因此，加強(qiáng)豬肉生產(chǎn)、零售鏈中沙門菌的監(jiān)測(cè)和防控具有重要的意義。

本試驗(yàn)從青海西寧地區(qū)屠宰場(chǎng)、零售店、超市等采集豬肉食品樣品246份進(jìn)行沙門菌分離鑒定，采用人工感染小鼠試驗(yàn)、Kauffmann-White法、K-B藥敏紙片法分別檢測(cè)沙門菌的致病性、血清型及耐藥性，分析該地區(qū)豬肉食品中沙門菌污染情況與耐藥情況，為進(jìn)一步防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 2019年6-12月，從青海西寧地區(qū)屠宰場(chǎng)、零售店、超市等采集豬肉食品樣品246份進(jìn)行沙門菌分離鑒定。

1.2 主要試劑 緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)、木糖賴氨酸(XLT-4)瓊脂，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂、沙門菌顯色培養(yǎng)基，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；2×TaqMaster Mix、DL-2 000 DNA Marker，均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；ID32E腸道菌生化鑒定試紙條、藥敏紙片，均購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；沙門菌屬診斷血清，購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司；細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)由法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)；PCR儀由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 25 g左右健康昆明系小鼠236只，購(gòu)自西寧市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)菌分離與培養(yǎng) 將采集的樣品分裝BPW，220 r/min 37 ℃培養(yǎng)8 h后，取100 μL 接種于TTB中，220 r/min 37 ℃培養(yǎng)8 h，劃線接種于XLT-4 平板，經(jīng) 37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取疑似沙門菌的黑色單菌落于沙門菌顯色培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取沙門菌顯色培養(yǎng)基的紫色單菌落接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純化培養(yǎng)，取純化培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡觀察。

1.4.2 細(xì)菌生化鑒定 按說(shuō)明書(shū)對(duì)純化培養(yǎng)的分離菌株調(diào)整為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?，接種到ID32E腸道菌生化鑒定試紙條中培養(yǎng)12～24 h，用細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化特性鑒定。

1.4.3 細(xì)菌PCR鑒定 按參考文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)沙門菌的特異性鑒定引物invA，上游為：5′-GAAATTATCGCCACGTTCGGGCA-3′，下游為：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGA-3′。引物片段大小為249 bp，由北京擎科生物科技有限公司合成。采用水煮法制備分離菌株的DNA模板，對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR鑒定，將PCR產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司合成進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的參考株進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.4.4 細(xì)菌致病性試驗(yàn)檢測(cè) 分離菌株用菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為1×108CFU/mL。每1株分離菌株用灌胃方式攻毒2只小鼠，劑量為0.25 mL(1×108CFU/mL)，對(duì)照組接種等量無(wú)菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯，攻毒的12 h后，觀察7 d，記錄小鼠的發(fā)病及死亡情況，進(jìn)行細(xì)菌學(xué)鑒定。

1.4.5 細(xì)菌血清型分型檢測(cè) 按參考文獻(xiàn)[6]采用Kauffmann-White法對(duì)分離的沙門菌進(jìn)行血清鑒定。

1.4.6 藥敏試驗(yàn) 按照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)操作、藥物試驗(yàn)和結(jié)果判斷。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離與培養(yǎng) 疑似沙門菌分離菌株在XLT-4 平板上長(zhǎng)出圓形、大小一致、濕潤(rùn)的、黑色的單菌落；在沙門菌顯色培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單個(gè)、大小一致、邊緣整齊的紫色菌落。革蘭染色鏡檢可見(jiàn)單個(gè)或成對(duì)存在、無(wú)芽孢、無(wú)莢膜、兩端鈍圓的陰性短桿菌。經(jīng)統(tǒng)計(jì)246份樣品中分離到了117株疑似沙門菌的菌株。

2.2 細(xì)菌生化試驗(yàn) 分離菌株用ID32E腸道菌生化鑒定試紙條和細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，117株被鑒定為沙門菌，評(píng)定結(jié)果合格率為99.7%～99.9%。其生化鑒定結(jié)果與報(bào)道的沙門菌的生化特性一致。

2.3 細(xì)菌PCR鑒定 用設(shè)計(jì)的沙門菌invA基因引物，對(duì)疑似菌株進(jìn)行 PCR 鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，117株疑似菌株均擴(kuò)增出大約為249 bp目的條帶，與預(yù)期的相符(見(jiàn)圖1)，分離菌株的測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的13株沙門菌參考株的同源性在98.9%～99.9%。說(shuō)明分離的117株菌株為沙門菌。

圖1 分離菌株的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Results of isolated strains PCR identificationM:DL-2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:空白對(duì)照；2～12:分離菌株M:DL-2 000 Marker;1:Blank control;2～12:Isolated strains

2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 攻毒組小鼠在攻毒后2～6 d 出現(xiàn)不同程度的死亡，主要呈現(xiàn)精神沉郁、采食量減少、腹瀉，個(gè)別未見(jiàn)臨床癥狀出現(xiàn)死亡，直到試驗(yàn)結(jié)束，從死亡的小鼠體內(nèi)分離到沙門菌，對(duì)照組的小鼠健康存活。據(jù)統(tǒng)計(jì)56株沙門菌能引起小鼠的死亡，為致病性沙門菌。

2.5 血清型檢測(cè) 對(duì)分離的56株致病性沙門菌進(jìn)行血清型鑒定。由表1可知，56株致病性沙門菌分別屬于10種不同的血清型，其中以豬霍亂沙門菌、鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌3種血清為主要流行致病血清型，分別占致病菌株的26.8%、21.4%和19.6%。

表1 致病性沙門菌血清型檢測(cè)Table 1 Serotype test results of pathogenic Salmonella

2.6 耐藥性分析 由表2可知，56株致病性沙門菌對(duì)氨芐西林、新霉素、阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶、慶大霉素5種藥物耐藥比較嚴(yán)重，耐藥率在85.7%～96.4%；對(duì)環(huán)丙沙星、紅霉素、林可霉素、強(qiáng)力霉素4種藥物的耐藥率在50%～75.0%；對(duì)其他藥物耐藥率在12.5%～35.7%。說(shuō)明分離的56株致病性沙門菌耐藥性嚴(yán)重。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity test results

3 討論

沙門菌具有廣泛的動(dòng)物宿主，可以引起多種動(dòng)物和人感染，是臨床中一種重要的人獸共患病致病菌，其感染人和動(dòng)物的途徑廣泛，沙門菌感染人會(huì)導(dǎo)致急性胃腸炎、敗血癥等疾病，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致死亡，沙門菌可以引起動(dòng)物的敗血癥、胃腸炎及其他組織和局部炎癥，并且會(huì)導(dǎo)致懷孕母畜流產(chǎn)[7]。相關(guān)研究表明，沙門菌主要存在于肉類食品中，人們食用被沙門菌污染的食物后也可能導(dǎo)致急性食物中毒，甚至引起死亡，因此，沙門菌菌株的出現(xiàn)和傳播對(duì)醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生十分重要[8]。沙門菌污染肉類產(chǎn)品引起食物中毒已經(jīng)成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

沙門菌可以感染多種宿主動(dòng)物，其抗原復(fù)雜且血清型眾多，沙門菌主要包括菌體 O 抗原、鞭毛H抗原和莢膜Vi抗原，目前世界發(fā)現(xiàn)了2 600多種沙門菌的血清型，我國(guó)發(fā)現(xiàn)的沙門菌血清型就有292種，其中有20種左右特定的沙門菌血清型易引起人獸患病，如雞白痢沙門菌、鼠傷寒沙門菌、傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌、腸炎沙門菌等[2-4]。研究表明，對(duì)人和動(dòng)物危害較大的沙門菌的血清型為鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌以及豬霍亂沙門菌等[5]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，從青海西寧地區(qū)采集的246份豬肉食品樣品中分離到了56株致病性沙門菌，屬于10種血清型，以豬霍亂沙門菌、鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌3種血清為主要流行致病血清型，分別占致病菌株的26.8%、21.4%和19.6%。說(shuō)明該省多地區(qū)豬肉食品中分離的致病性沙門菌血清型復(fù)雜。金宣晨[4]報(bào)道了豬產(chǎn)業(yè)鏈中分離的沙門菌以德?tīng)柋吧抽T菌(35.1%)和鼠傷寒沙門菌(31.0%)為優(yōu)勢(shì)血清型。李鵬[6]報(bào)道了酒泉市市售冷凍羊肉分離的沙門菌以鼠傷寒型和德比型所占比例最高。張強(qiáng)等[9]報(bào)道了從楊凌及周邊地區(qū)零售分割雞肉中分離的34株沙門菌中共檢出10種血清型，其中科瓦利斯沙門菌最為流行。與本試驗(yàn)均有一定差異性，可能與地區(qū)及分離不同種類的動(dòng)物肉類有關(guān)。

沙門菌易產(chǎn)生耐藥性，沙門菌耐藥性可以通過(guò)抗生素耐藥質(zhì)粒、整合子和轉(zhuǎn)座子攜帶的可轉(zhuǎn)移元件作為抗生素耐藥性傳遞的供體，可以通過(guò)抗生素耐藥基因元件一起轉(zhuǎn)移，將編碼耐藥基因轉(zhuǎn)移到不同宿主上，促進(jìn)具毒性和耐藥性的細(xì)菌分離株的出現(xiàn)，通過(guò)食物鏈在人和動(dòng)物中傳播[10]。因此，沙門菌耐藥性對(duì)人和動(dòng)物危害較大。本試驗(yàn)結(jié)果表明，分離的56株致病性沙門菌分離株對(duì)氨芐西林、新霉素、阿莫西林等9種藥物耐藥率在50%以上，對(duì)其他藥物耐藥率在12.5%～35.7%。表明青海西寧地區(qū)豬肉食品中分離沙門菌耐藥性嚴(yán)重，可能與該地區(qū)生豬養(yǎng)殖過(guò)程中不合理的使用抗菌藥物有關(guān)，應(yīng)該引起重視。