駱曉峰，陳韓冰，李靚蕾，王元翊，莊炳徽，黃雅萌，張宸豪

(吉林醫(yī)藥學(xué)院,吉林 吉林 132013)

通迅作者：張宸豪，E-mail:zhangchenhao0618@163.com

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常見于老年人的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，60歲以上人群中發(fā)病比例為1%，且隨年齡增長發(fā)病率呈上升趨勢，臨床表現(xiàn)主要以震顫、肌肉強(qiáng)直、運(yùn)動減少、步態(tài)失調(diào)等運(yùn)動癥狀為特征[1-2]。隨病情發(fā)展，除運(yùn)動癥狀外患者幾乎不可避免的出現(xiàn)睡眠障礙、抑郁、焦慮、癡呆等一系列非運(yùn)動癥狀。其中以睡眠障礙發(fā)生率最高，67%～98%的PD患者存在睡眠障礙，包括失眠、入睡困難、睡眠片段化、快動眼睡眠障礙、日間睡眠過多、睡眠發(fā)作、睡眠覺醒周期改變等多種形式[3-4]，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。褪黑素(Melatonin,MT)是松果體分泌的吲哚類激素，對生物的晝夜節(jié)律、性成熟、氧化應(yīng)激均有調(diào)節(jié)作用[5]。近年來國內(nèi)外學(xué)者證實(shí),MT能影響清醒與睡眠狀態(tài)的轉(zhuǎn)換，給予MT對睡眠有特異性誘導(dǎo)效應(yīng)，補(bǔ)充外源性MT有助于恢復(fù)生物鐘的節(jié)律，誘導(dǎo)自然睡眠，提高睡眠質(zhì)量[6]。因此，補(bǔ)充MT有可能成為改善PD患者睡眠障礙的選項(xiàng)，本試驗(yàn)通過大鼠PD模型驗(yàn)證補(bǔ)充MT改善PD睡眠障礙的作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 清潔級Wistar大鼠50只，體重190～220 g，雌雄各半，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[許可證號SCXK-(吉)2007-0003]。大鼠于試驗(yàn)前2周飼養(yǎng)于室溫(20±2)℃，人工光照周期下動物房內(nèi)，光照條件如下：明暗比為12 h∶12 h，開燈時(shí)間為早7:00，關(guān)燈時(shí)間為晚19:00，光照強(qiáng)度為300 Lux，自由進(jìn)食、飲水，試驗(yàn)過程中對動物處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒布的《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》的規(guī)定。6-羥基多巴(批號：H116)、阿卟嗎啡(批號：M5250)、褪黑素(批號：SML2331)，均購自美國Sigma-Aldrich公司；抗壞血酸(批號：50-81-7)，購自上海時(shí)代生物技術(shù)有限公司；腦立體定位儀，購自深圳瑞沃德公司；腦電信號采集分析系統(tǒng)，購自成都泰盟公司；高效液相色譜儀，購自日本島津公司；振動切片機(jī)，購自德國萊卡公司；CR22G高速離心機(jī)，購自日本日立公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠帕金森模型 40只大鼠經(jīng)10%水合氯醛按0.4 mL/(100 g·bw)腹腔注射麻醉后，頭部固定置于腦立體定位儀上。剪除毛發(fā)，顱頂做4～5 cm縱行切口，剔除軟組織后顱鉆開顱，暴露硬腦膜，使用微量注射器吸取4 μL的6-羥基多巴(6-OHDA 16 μg，抗壞血酸0.02%)溶液，參照Paxinos&Watson腦圖譜，選取前腦內(nèi)側(cè)束(Medial forebrain bundle，MFB)坐標(biāo)(Berge 4，LR 1.7，H 8)通過微量注射器以0.5 μL/min速度進(jìn)行腦內(nèi)注射，并留針8～10 min后緩慢拔針。術(shù)后縫合皮膚，待大鼠清醒后，置于干凈鼠籠中，連續(xù)3 d腹腔注射青霉素(4萬單位/只)，飼養(yǎng)28 d后進(jìn)行模型鑒定。通過阿卟嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)鑒定PD模型是否成功，在安靜環(huán)境中，大鼠腹腔注射新鮮配制阿卟嗎啡2 mg/(kg· bw)后，置于直徑30 cm的圓形容器中，記錄30 min大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，隔日1次，共3次，3次誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)均大于210 r/30 min的大鼠被視為制備成功的PD模型大鼠，用于下一步試驗(yàn)。

1.2.2 試驗(yàn)分組 經(jīng)檢測40只大鼠制備模型成功21只，PD模型制備成功率為52%。將試驗(yàn)動物分為正常對照組(對照組，Control group)、帕金森模型組(PD組，PD group)及褪黑素補(bǔ)充組(MT組，MT group),每組10只,共30只。MT組選取PD模型大鼠每日21:00通過腹腔注射給予MT溶液，每天50 mg/(kg·bw)，共4周，對照組及PD組相同時(shí)間給予等量生理鹽水。

1.2.3 腦電電極與肌電電極安放 將大鼠固定于腦立體定位儀上。切開皮膚暴露顱骨，參照Paxinos&Watson圖譜使用顱鉆在冠狀縫前1 mm及人字縫前1 mm與顱骨中線兩側(cè)旁開1 mm交叉點(diǎn)處鉆孔，將3個(gè)腦電電極植入顱骨內(nèi)，深度以穿透顱骨，剛好能接觸到硬腦膜為準(zhǔn)，隨后使用牙科水泥固定大鼠腦電電極，將2個(gè)肌電電極分別插在大鼠左、右側(cè)頸部深肌層，術(shù)后腹腔注射青霉素(4萬單位/只)，連續(xù)3 d，恢復(fù)1周開始記錄大鼠的腦電及肌電。

1.2.4 多導(dǎo)睡眠記錄及分析 腦電圖(Electroencephalogram，EEG)和肌電圖(Electromyography，EMG)信號經(jīng)過放大濾過(EEG：0.3～100 Hz；EMG：10～100 Hz)，再以256 Hz掃描速度進(jìn)行自動記錄,各組均記錄EEG和EMG 72 h，并自動以10 s為1個(gè)時(shí)間段分析、鑒別，對睡眠覺醒周期進(jìn)行分析。EEG的頻率區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)為：delta 0.6～4 Hz，theta 6～10 Hz，Alpha 12～14 Hz。

1.2.5 紋狀體樣品采集及高效液相色譜分析樣品處理 將大鼠用10%水合氯醛按0.4 mL/(100 g·bw)腹腔注射麻醉后，迅速斷頭取腦置于0～4 ℃的人工腦脊液中，修塊后用502膠水固定于振動切片機(jī)切片。在腦片中仔細(xì)分離出紋狀體組織樣品，將1 mg樣品加入0.04 moL/L高氯酸100 μL，超聲粉碎30 s，使細(xì)胞破碎，在4 ℃離心機(jī)內(nèi)以14 000 r/min的速度離心30 min，留取上清液，每組紋狀體樣品準(zhǔn)確吸取20 μL進(jìn)行高效液相色譜法(HPLC)分析測定，記錄出峰時(shí)間與峰面積，用Breeze 2軟件計(jì)算單位體積樣品多巴胺的含量。色譜檢測條件如下：色譜柱：C18(150 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相：0.1 moL/L的醋酸鈉溶液，用冰醋酸調(diào)pH=5.1時(shí)，按9∶1的比例與甲醇溶液混合，超聲脫氣5 min；激發(fā)光波長為290 nm，發(fā)射光波長為330 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣體積為20 μL，流速0.5 mL/min。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)結(jié)果以Means±SD的形式表示。應(yīng)用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用One-way ANOVA法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。通過Graphpad Prism 6.0作圖。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 MT補(bǔ)充注射對PD模型鼠總睡眠時(shí)間的影響 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對照組大鼠總睡眠時(shí)間為(754±32)min,PD組總睡眠時(shí)間為(175.3±27.7)min,對照組總睡眠時(shí)間明顯高于PD組總睡眠時(shí)間，兩者差異性顯著(P<0.05),MT組總睡眠時(shí)間為(295.5±57.7)min,對照組總睡眠時(shí)間高于MT組總睡眠時(shí)間，兩者差異性顯著(P<0.05),與PD組相比，MT組總睡眠時(shí)間明顯延長，兩組差異性顯著(P<0.05)，見圖1。

圖1 褪黑素補(bǔ)充注射對帕金森模型鼠總睡眠時(shí)間的影響Fig.1 Effects of melatonin supplementation on total sleep time in Parkinson’s disease model rats*：P<0.05;下圖同*：P<0.05.The same as below figures

2.2 MT補(bǔ)充注射對PD模型鼠覺醒時(shí)間的影響 對照組覺醒時(shí)間(712±63)min,PD組覺醒時(shí)間為(1 195±102)min,PD組覺醒時(shí)間明顯高于對照組，兩者相比差異性顯著(P<0.05),MT組覺醒時(shí)間為(880±47)min,與PD組相比，MT組覺醒時(shí)間明顯縮短，差異性顯著(P<0.05)，見圖2。

圖2 褪黑素補(bǔ)充注射對帕金森模型鼠覺醒時(shí)間的影響Fig.2 The effect of melatonin supplementation on the wake-up time of Parkinson’s model rats

2.3 MT補(bǔ)充注射對PD模型鼠慢波睡眠時(shí)間的影響 對照組慢波睡眠時(shí)間(544±33)min,PD組慢波睡眠時(shí)間為(113±23)min,PD組慢波睡眠時(shí)間與對照組慢波睡眠時(shí)間相比明顯縮短，兩者差異性顯著(P<0.05),MT組慢波時(shí)間為(207±22)min,對照組慢波睡眠時(shí)間與MT組慢波睡眠時(shí)間相比，兩者差異性顯著(P<0.05),PD組慢波睡眠時(shí)間與MT組慢波睡眠時(shí)間相比，兩組差異性顯著(P<0.05)，MT組慢波睡眠時(shí)間明顯延長，見圖3。

圖3 褪黑素補(bǔ)充注射對帕金森模型鼠慢波睡眠時(shí)間的影響Fig.3 Effect of melatonin supplementation on slow wave sleep time in Parkinson model rats

2.4 MT補(bǔ)充注射對PD模型鼠快波睡眠時(shí)間的影響 對照組快波睡眠時(shí)間(241±32)min,PD組快波睡眠時(shí)間為(65±19)min,PD組快波睡眠時(shí)間明顯減少(P<0.05)，MT組快波睡眠時(shí)間為(85±14)min，與PD組相比差異性不顯著(P>0.05)，見圖4。

圖4 褪黑素補(bǔ)充注射對帕金森模型鼠快波睡眠時(shí)間的影響Fig.4 Effect of melatonin supplementation on fast wave sleep time in Parkinson’s model rats

2.5 MT補(bǔ)充注射對大鼠紋狀體內(nèi)多巴胺遞質(zhì)含量的影響 對照組紋狀體多巴胺遞質(zhì)含量(560±20.7)pg/mg,PD組紋狀體多巴胺遞質(zhì)含量為(170.4±15.5)pg/mg,對照組紋狀體多巴胺遞質(zhì)含量明顯高于PD組，兩者差異性顯著(P<0.05)，MT組紋狀體多巴胺遞質(zhì)含量為(245.5±37.2)pg/mg,對照組紋狀體多巴胺遞質(zhì)含量明顯高于MT組，兩者差異性顯著(P<0.05),與PD組相比，MT組紋狀體多巴胺遞質(zhì)含量明顯高于PD組，差異性顯著(P<0.05)，見圖5。

圖5 各試驗(yàn)組大鼠紋狀體內(nèi)多巴胺含量變化Fig.5 Changes of dopamine content in striatum of rats in each experimental group

3 討論

PD是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，除運(yùn)動癥狀外，常伴有如睡眠障礙、情感障礙、自主神經(jīng)功能紊亂等非運(yùn)動癥狀，以睡眠障礙發(fā)生率最高，67%～98%的PD患者存在睡眠障礙。睡眠障礙包括失眠、睡眠片段化、睡眠周期改變等多種形式，可能與多種因素有關(guān)，如PD病人腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)變化、抗PD藥物的副作用及疾病本身的神經(jīng)退行性變化等[7]。

本試驗(yàn)通過MFB注射6-OHDA，建立PD模型。此方法保留大鼠的吞咽功能，對大鼠的運(yùn)動能力影響小，術(shù)后大鼠可以長期存活，并可進(jìn)一步通過腦電活動記錄PD模型大鼠的睡眠改變情況。Pungor K等[8]用貓建立PD模型，發(fā)現(xiàn)其快動眼睡眠選擇性受到抑制。Barraud Q等[9]用MPTP建立靈長類PD模型，發(fā)現(xiàn)快動眼睡眠受到抑制，睡眠片段化明顯，覺醒發(fā)生的次數(shù)增多，持續(xù)時(shí)間延長。本試驗(yàn)在PD大鼠模型的觀察結(jié)果與其他學(xué)者一致，試驗(yàn)結(jié)果顯示，PD模型大鼠總睡眠時(shí)間減少，覺醒時(shí)間延長，慢波睡眠減少、快波睡眠抑制、睡眠效率降低。

MT是松果體分泌的吲哚類激素，近年來證實(shí)[10]MT影響清醒-睡眠狀態(tài)轉(zhuǎn)換，對睡眠有特異性誘導(dǎo)效應(yīng)。本試驗(yàn)外源性補(bǔ)充MT后發(fā)現(xiàn)MT組總睡眠時(shí)間、慢波睡眠時(shí)間與PD組相比明顯延長，而覺醒時(shí)間與PD組相比明顯縮短，但兩組快波睡眠時(shí)間則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。試驗(yàn)結(jié)果說明，外源性補(bǔ)充MT可改善PD模型大鼠的睡眠障礙，增加總睡眠時(shí)間，減少覺醒時(shí)間，并且MT引起的睡眠改善主要表現(xiàn)在慢波睡眠時(shí)相延長，而快波睡眠時(shí)相則無明顯改變。

研究發(fā)現(xiàn)[11-14]，黑質(zhì)-紋狀體多巴胺通路與MT通路的信息在下丘腦外側(cè)部交匯，黑質(zhì)、紋狀體、腹側(cè)被蓋區(qū)等部位均可檢測到MT受體。Zisapel N[15]與 Brito-Armas J M等[16]研究發(fā)現(xiàn),MT影響腦內(nèi)多巴胺(DA)遞質(zhì)的釋放，并通過線粒體保護(hù)及抗氧化作用對神經(jīng)退行性變具有保護(hù)作用。Capitelli C、Willis G L等[17-18]研究證實(shí)，MT可減少M(fèi)TPT動物模型的多巴胺神經(jīng)元缺失。本試驗(yàn)通過HPLC測定紋狀體內(nèi)多巴胺含量的變化也發(fā)現(xiàn)MT組紋狀體多巴胺遞質(zhì)含量明顯高于PD組，因此推測外源性補(bǔ)充MT改善PD模型大鼠的睡眠障礙的作用很可能是 MT發(fā)揮其抗氧化效應(yīng)，對中腦多巴胺神經(jīng)元產(chǎn)生了保護(hù)性作用，進(jìn)而提高紋狀體內(nèi)多巴胺含量來實(shí)現(xiàn)。