趙依威，姜芳燕，李春，戴大章

（北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，北京100081）

引 言

磷脂酶（phospholipase, PL）是催化磷脂水解的一類酶的總稱，廣泛應(yīng)用于油脂精煉、磷脂改性與生物醫(yī)藥等領(lǐng)域[1]。根據(jù)PL作用位點(diǎn)的不同可分為PLA1、PLA2、PLB、PLC、PLD（圖1）。PLA1是專一水解天然磷脂Sn?1 位?；拿?，可以得到Sn?2 酰基溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰膽堿；PLA2專一催化水解磷脂Sn?2 位?；?，生成溶血磷脂和脂肪酸；PLC作用于磷脂酰膽堿，生成甘油二酯和磷脂膽堿；PLD 水解磷脂酰膽堿生成磷脂酸和膽堿，而PLB 則能同時(shí)水解磷脂Sn?1 位和Sn?2 位?；?，具有酯水解酶和溶血磷脂酶?轉(zhuǎn)?；傅幕钚浴L是一類界面酶，在異相系統(tǒng)(油、水界面)中具有較高的催化活性，具有界面激活（interfacial activation）現(xiàn)象[2]。

圖1 PL作用于磷脂分子位點(diǎn)示意圖（X代表氫、膽堿、乙醇胺、絲氨酸、肌醇等）Fig.1 The diagram of phospholipases acting on sites of the phosphatidylcholine

本課題組從油脂廠附近土壤中篩選到一株P(guān)LB高產(chǎn)菌株P(guān)seudomonas fluorescens BIT?18[3]，該菌株能產(chǎn)生高活性PLB（Pf?PLB），首次克隆到Pf?PLB 基因（GenBank登錄號(hào)：HQ401021.1），構(gòu)建了表達(dá)載體pET?28a(+)?pfplb，并將其成功轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞E. coli BL21(DE3)中，實(shí)現(xiàn)了Pf?PLB 的誘導(dǎo)型表達(dá)[4]。利用自行構(gòu)建的工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)的rPf?PLB 對(duì)大豆毛油進(jìn)行脫膠時(shí)，豆油磷含量由234 mg/kg 下降至4.1 mg/kg，達(dá)到了植物油精煉的國家標(biāo)準(zhǔn)（10 mg/kg）和歐州標(biāo)準(zhǔn)（5 mg/kg），顯示了良好的應(yīng)用前景。為進(jìn)一步優(yōu)化工藝參數(shù)和拓展其應(yīng)用范圍，本文將對(duì)Pf?PLB 界面催化的分子機(jī)制進(jìn)行探討，旨在為PLB的理性改造及其工業(yè)化推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

Pseudomonas fluorescens BIT?18 磷 脂 酶B（Pf?PLB），本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵生產(chǎn)。大豆磷脂，北京美亞斯磷脂技術(shù)有限公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 軟件

多重序列比對(duì)軟件ClustalX 2.0 和DNAMAN 10.0；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬軟件Modeller 9.18；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)顯示工具Swiss Pdb?Viewer 4.1等。

1.3 主要分子操作及酶分離純化

細(xì)菌總DNA 提取、回收DNA、感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、突變體構(gòu)建等操作參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。

1.4 氨基酸序列理化性質(zhì)分析

參考文獻(xiàn)[6]的方法，采用瑞士生物信息研究所開發(fā)的ExPASy（Expert Protein Analysis System）中的ProtParam 分析Pf?PLB 的氨基酸組成、分子量、等電點(diǎn)（pI）等基本理化特性。

1.5 序列同源性分析

將Pf?PLB 氨基酸序列提交NCBI 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行BLASTP 比對(duì)，搜索同源蛋白序列；將所測序列通過BLASTN 與NCBI 數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比對(duì)，查找相似核酸序列，利用軟件ClustalX 2.0 和MEGA 4.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 Pf-PLB蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用PredictProtein[7]和SOMPA[8]分析Pf?PLB 的二級(jí)結(jié)構(gòu)；采用Modeller 9.18[9]同源建模預(yù)測Pf?PLB的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 Pf-PLB氨基酸序列理化性質(zhì)分析

基于Pf?PLB 一級(jí)序列，借助于ExPASy 軟件中的ProtParam 與ProtScale 模塊對(duì)Pf?PLB 的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析。ProtParam 分析結(jié)果表明，Pf?PLB 的GRAVY（grand average of hydropathicity）值為?0.298，說明Pf?PLB 為親水蛋白（在2 與?2 之間，正值表明此蛋白為疏水蛋白，負(fù)值表明為親水蛋白）；ProtScale 分析結(jié)果表明，Pf?PLB 的N 末端含有較多的疏水性殘基，而C 末端氨基酸序列則表現(xiàn)為較明顯的親水性（圖2）。

圖2 ProtScale對(duì)Pf?PLB的疏水性的分析（正值為疏水，負(fù)值為親水）Fig.2 Analysis of the hydropathicity of Pf?PLB by ProtScale

一般來說，蛋白質(zhì)親水區(qū)多位于分子表面，這種結(jié)構(gòu)有利于維持其在水溶液中的穩(wěn)定性。若某區(qū)域疏水性較強(qiáng)卻位于分子表面，則會(huì)影響其在水溶液中的穩(wěn)定性。例如P.aeruginosa 脂肪酶的N 端具有強(qiáng)疏水性且位于分子表面，因此該蛋白在水溶液中容易通過疏水作用發(fā)生聚集或吸附[10]。因此，根據(jù)ProtParam 和ProtScale 分析結(jié)果，結(jié)合其在溶液中的穩(wěn)定性特征，初步判斷Pf?PLB 的親水性C 端位于酶蛋白分子表面，疏水性N端位于內(nèi)部，而酶蛋白分子總體上表現(xiàn)為親水性。

2.2 Pf-PLB蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測大多以已知三維結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)為依據(jù)。因此，根據(jù)Pf?PLB 的氨基酸序列，采用SOMPA 來分析Pf?PLB 的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3）。結(jié)果表明，在Pf?PLB 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，含有較高比例的無規(guī)卷曲（54.14%），其余為β?折疊片層（24.59%）和α?螺旋（17.97%），此外還有少量的β?轉(zhuǎn)角（3.31%）。此外，PredictProtein 預(yù)測Pf?PLB 為球狀蛋白，其序列中不含半胱氨酸，因此不形成二硫鍵。

2.3 Pf-PLB界面催化機(jī)制分析

Pf?PLB 是一類能夠降解磷脂的酯酶，在異相系統(tǒng)(油、水界面)中具有較高的催化活性。此類酶大多具有一個(gè)共同特點(diǎn)，即具有“艙蓋(hatch)”結(jié)構(gòu)域，其覆蓋在活性位點(diǎn)，阻止底物“非請(qǐng)自入”[11]。經(jīng)同源建模分析，Pf?PLB 結(jié)構(gòu)與P.aeruginosa FadL 蛋白結(jié)構(gòu)、E.coli FadL蛋白結(jié)構(gòu)之間有以下共性特征（圖4）：整體結(jié)構(gòu)為14 個(gè)Strand 組成的β?桶；Loop 3 和Loop 4在β?桶上側(cè)，形成類似蓋子（lid）結(jié)構(gòu)域；第3個(gè)Strand 形成扭結(jié)（kink）結(jié)構(gòu)，從而使β?桶側(cè)面有一個(gè)側(cè)向開口；三個(gè)α?螺旋形成hatch 結(jié)構(gòu)域，作為β?桶的桶底。

圖3 SOMPA對(duì)Pf?PLB進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prediction of secondary structure of Pf?PLB by SOMPA

圖4 Pf?PLB與來源于E.coli和P.aeruginosa的FadL結(jié)構(gòu)比較Fig.4 Structure comparison between Pf?PLB and FadL from E.coli and P.aeruginosa

圖5 Pf?PLB界面催化的可能機(jī)制Fig.5 Possible mechanism of Pf?PLB interfacial catalysis

基于Pf?PLB 結(jié)構(gòu)特征，參考Berg 等[12]和Hearn等[13]在Science 和Nature 上對(duì)Pf?PLB 同源結(jié)構(gòu)FadL的描述，本文提出“掀蓋進(jìn)入，側(cè)向離去”假說模型（圖5），以闡述Pf?PLB 界面催化的可能機(jī)制。模型假定Pf?PLB 催化底物磷脂的過程主要有以下幾個(gè)步驟：①受Pf?PLB 分子的低親和力結(jié)合位點(diǎn)吸引，界面上的底物磷脂逐漸靠近β?桶；②當(dāng)?shù)孜锪字咏?桶時(shí)，Loop 3 和Loop 4 發(fā)生結(jié)構(gòu)調(diào)整，敞開蓋子結(jié)構(gòu)域（lid）便于底物進(jìn)入β?桶，即“掀蓋進(jìn)入”；③底物進(jìn)入β?桶后，依次與低親和力結(jié)合位點(diǎn)、高親和力結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合；④底物磷脂在Pf?PLB 活性中心催化基團(tuán)作用下，水解生成磷酸甘油酸和游離脂肪酸，同時(shí)Pf?PLB 的N 端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)發(fā)生調(diào)整，以便產(chǎn)物從第3 個(gè)Strand 的扭結(jié)（kink）結(jié)構(gòu)側(cè)口離開β?桶，即“側(cè)向離去”。

為驗(yàn)證上述機(jī)制，采用定點(diǎn)突變方法將Pf?PLB第3個(gè)Strand 上126位苯丙氨酸L（CTC）突變?yōu)榫彼酭（CGA），同時(shí)將第2 個(gè)Strand 上103 位纈氨酸V（GTA）突變?yōu)楣劝彼酔（GAA），將雙重突變Pf?PLB的催化特性與單重突變和未突變Pf?PLB 進(jìn)行比較分析。由于精氨酸和谷氨酸分別帶有正電荷和負(fù)電荷，因此可形成鹽橋，形成的鹽橋可關(guān)閉S3 和S2之間的側(cè)向開口，造成產(chǎn)物的釋放障礙，使Pf?PLB催化活性大幅降低（圖6）。

結(jié)果表明，V103E 突變體Pf?PLB 和L126R 突變體Pf?PLB 的活性分別是未突變Pf?PLB 的83.9%和74.2%，而V103E/L126R 雙重突變體Pf?PLB 的活性則僅為未突變Pf?PLB的7%。同時(shí)，Modeller分子模擬結(jié)果顯示，未突變Pf?PLB[圖7（a）]在S2 和S3 之間有明顯的側(cè)向開口，而突變Pf?PLB（V103E/L126R）[圖7（b）]則沒有側(cè)向開口。這些結(jié)果較好地佐證了本文提出的“掀蓋進(jìn)入，側(cè)向離去”假說機(jī)制：V103E/L126R 雙重突變體Pf?PLB 的103 位谷氨酸和126位精氨酸間形成了鹽橋，關(guān)閉了S3和S2之間的側(cè)向開口，從而阻止了產(chǎn)物從β?桶的側(cè)向開口離去，導(dǎo)致產(chǎn)物在β?桶內(nèi)大量積聚而形成產(chǎn)物抑制，因此V103E/L126R雙重突變體Pf?PLB 的催化活性大幅降低。

圖6 不同菌株所產(chǎn)Pf?PLB活性分析Fig.6 Activity analysis of Pf?PLB from different strains

圖7 Pf?PLB的Modeller模擬Fig.7 Modeller simulation of Pf?PLB

3 結(jié) 論

采用同源建模的方法研究了Pf?PLB 的三維空間結(jié)構(gòu)，并基于其結(jié)構(gòu)特征，在分子水平上了提出了“掀蓋進(jìn)入，側(cè)向離去”假說模型，闡述了Pf?PLB界面催化的可能機(jī)制，并采用定點(diǎn)突變對(duì)Pf?PLB 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改造，分別考察突變體Pf?PLB 與單重突變和未突變Pf?PLB 的催化特性，從而對(duì)所提出的機(jī)制模型進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，雙重突變體Pf?PLB的103 位谷氨酸和126 位精氨酸間形成的鹽橋關(guān)閉了β?桶的側(cè)向開口，造成產(chǎn)物釋放障礙，引起產(chǎn)物在β?桶內(nèi)大量積聚而形成產(chǎn)物抑制，致使其催化活性大幅降低。磷脂酶B 界面催化分子機(jī)制的研究，對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)理性改造及其工業(yè)化推廣應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。