張 玉 李延玲 李書印 李 進 (南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)，南陽 473058)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。我國是胃癌高發(fā)國家，其發(fā)病率和死亡率分別占全世界的42.6%和45%。對于處于早期的胃癌，手術(shù)切除能取得較好的治療效果。但胃癌起病隱匿，早期癥狀和體征不明顯，導(dǎo)致多數(shù)患者初次診斷時已經(jīng)處于晚期。晚期胃癌多已發(fā)生肝臟、腹膜、周圍臟器和淋巴遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，難以實施手術(shù)治療。化療治療處于轉(zhuǎn)移期胃癌的主要作用是改善患者生活質(zhì)量和延長生存期，且具有較大的毒副作用。曲妥珠單抗和貝伐單抗等靶向藥價格昂貴且臨床應(yīng)用需綜合考量，因此尋找高效低毒且來源廣泛的治療藥物具有重要意義。近年來白樺樹皮的藥理作用受到廣泛關(guān)注，其提取物具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降脂、利膽保肝等作用[1]。白樺脂醇是白樺皮中提取的羽扇烷型三萜類化合物，是白樺樹皮提取物中重要的活性成分。白樺脂醇對人體無毒，具有抗菌、抗病毒、神經(jīng)保護、消炎、抗過敏等藥理學(xué)作用[2,3]。大量研究顯示，白樺脂醇對多種類型的癌癥具有抑制作用，如人乳腺癌、肺癌、胰腺癌等[4-6]。但白樺脂醇對人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖和凋亡的影響尚未見報道。本文以體外培養(yǎng)的人胃癌MGC-803細(xì)胞為研究對象，探討白樺脂醇對MGC-803細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為白樺脂醇抑癌的后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 白樺脂醇(純度>98%，CAS：473-98-3)購自南京春秋生物；人胃癌MGC-803細(xì)胞株購自美國ATCC公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)(貨號：YS-SO-000869)購自日本同仁研究所；DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號：11965-092)和胎牛血清(貨號：12662-029)購自美國Gibco公司；胰酶和青霉素-鏈霉素雙抗購自美國Hyclone公司；抗體Ki67(貨號：ab16667)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating，PCNA)(貨號：ab18197)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinae，PI3K)(貨號：32089)、p-AKT(貨號：ab38449)、Bax(貨號：ab32503)、Cleaved caspase-9(貨號：ab2324)、Cleaved caspase-3(貨號：ab13847)、Bcl-2(貨號：ab32124)、p65(貨號：ab16502)、mTOR(貨號：32028)、Annexin V-PI凋亡檢測試劑盒(貨號：abs50001A)購自北京賽寶克公司；磷酸化蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)(貨號：ab8805)、GAPDH抗體(貨號：ab8245)購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞MGC-803接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱。單層細(xì)胞覆蓋率達80%左右時傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.2.2藥物毒性實驗 將細(xì)胞分為：對照組、白樺脂醇低劑量組(10 μmol/L)、白樺脂醇中劑量組(20 μmol/L)和白樺脂醇高劑量組(50 μmol/L)，取對數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個/ml接種于96孔板(100 μl/孔)。37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h后，向?qū)?yīng)孔中補充10 μl不同濃度的白樺脂醇，每組設(shè)置3個復(fù)孔，設(shè)置空白對照組(不加細(xì)胞懸液和藥物)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。向細(xì)胞中添加10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測其490 nm處吸光值。細(xì)胞存活率=(OD藥物-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%。

1.2.3細(xì)胞計數(shù)試劑盒檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞分組同1.2.2，取對數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個/ml接種于96孔板(100 μl/孔)，37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h后，向?qū)?yīng)的孔中補充10 μl不同濃度的白樺脂醇，每組設(shè)置3個復(fù)孔，設(shè)置空白對照組(不加細(xì)胞懸液和藥物)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h。向細(xì)胞中添加10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光值。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，當(dāng)覆蓋率達90%左右時，換含不同濃度白樺脂醇的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，PBS清洗2次，加含蛋白酶抑制劑的裂解液，置于冰上30 min使細(xì)胞充分裂解。4℃下15 000 r/min離心20 min，取上清，BCA法測蛋白濃度。加蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min后，每孔上樣30 μg蛋白，12% SDS-PAGE分離樣品。轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA室溫下封閉1 h；轉(zhuǎn)入稀釋后的一抗Ki67(1∶2 000)、PCNA(1∶2 000)、PI3K(1∶2 000)、p-AKT(1∶ 2 000)、Bax(1∶2 000)、Cleaved caspase-3(1∶2 000)、Cleaved caspase-3(1∶2 000)，4℃搖床孵育過夜，TBST洗滌10 min×3次；加二抗室溫下孵育1 h，TBST洗滌10 min×3次；加ECL顯影液，成像系統(tǒng)中拍照。Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞，于不同濃度白樺脂醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，1 500 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗2次，加入200 μl Binding buffer重懸細(xì)胞，加入10 μl Annexin V于4℃避光條件下孵育30 min，加10 μl PI室溫避光孵育5 min后，上流式細(xì)胞儀檢測。采用Cellquest軟件進行分析，Anv+PI-為早期凋亡細(xì)胞，Anv+PI+為晚期凋亡細(xì)胞。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS18.0分析。兩組間比較使用t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同濃度白樺脂醇對MGC-803細(xì)胞存活的影響 當(dāng)白樺脂醇的濃度低于50 μmol/L時，對MGC-803細(xì)胞活性無顯著影響；當(dāng)白樺脂醇的濃度大于50 μmol/L時，MGC-803細(xì)胞活性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 白樺脂醇分子式及不同濃度白樺脂醇對MGC-803細(xì)胞活性的影響

2.2白樺脂醇對MGC-803細(xì)胞增殖的影響 實驗結(jié)果如圖2所示，不同濃度白樺脂醇處理人胃癌MGC-803細(xì)胞0～4 d后，細(xì)胞增殖倍數(shù)呈不同程度的降低，其作用效果具有白樺脂醇劑量性和時間依賴性。在第4天時，白樺脂醇各組細(xì)胞增殖倍數(shù)低于MGC-803組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明白樺脂醇能夠抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖。

圖2 CCK-8檢測白樺脂醇對MGC-803細(xì)胞增殖的影響

2.3白樺脂醇對MGC-803細(xì)胞中Ki67和PCNA表達的影響 Western blot結(jié)果如圖3所示，MGC-803細(xì)胞經(jīng)不同濃度的白樺脂醇處理48 h后，白樺脂醇低劑量組細(xì)胞中Ki67表達水平無明顯變化，PCNA表達水平降低(P<0.01)；白樺脂醇中、高劑量組Ki67和PCNA表達水平降低(P<0.01)，且降低作用呈白樺脂醇劑量依賴性，表明白樺脂醇能抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白Ki67和PCNA表達。

圖3 Western blot檢測白樺脂醇對增殖相關(guān)蛋白表達的影響

2.4白樺脂醇對MGC-803細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，不同濃度白樺脂醇處理MGC-803細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡比率顯著增加(P<0.01),且其作用具有白樺脂醇劑量依賴性，見圖4。結(jié)果表明白樺脂醇誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測白樺脂醇對MGC-803細(xì)胞凋亡的影響

2.5白樺脂醇對MGC-803細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 不同濃度白樺脂醇處理MGC-803細(xì)胞后，細(xì)胞中Bcl-2的表達水平降低，而Bax、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達水平顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且其變化具有白樺脂醇劑量依賴性，見圖5。

圖5 Western blot檢測白樺脂醇對MGC-803細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

2.6白樺脂醇對PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達水平的影響 不同濃度白樺脂醇處理胃癌細(xì)胞后，細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的比率降低，NF-κB p65和mTOR表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述變化具有白樺脂醇劑量依賴性，見圖6。

圖6 Western blot檢測PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白的表達水平

3 討論

白樺脂醇是常見的三萜類化合物，可從白樺等植物中獲取。研究顯示，白樺脂醇及其衍生物可作為潛在的腫瘤治療藥物，對多種類型的腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，如白樺脂醇能誘導(dǎo)多藥耐藥性的人腎癌細(xì)胞凋亡[7-9]。本文在此基礎(chǔ)上研究白樺脂醇對人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖和凋亡的影響。采用藥物毒性實驗檢測不同濃度白樺脂醇對MGC-803細(xì)胞活性影響，根據(jù)實驗結(jié)果選擇濃度為10、20、50 μmol/L的白樺脂醇用于后續(xù)實驗。

無限增殖是惡性腫瘤細(xì)胞的重要特征之一。Li等[10]實驗發(fā)現(xiàn)白樺脂醇通過激活A(yù)MPK信號通路，抑制肺癌細(xì)胞增殖。Orchel等[11]研究顯示白樺脂醇及其衍生物能抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，不同濃度白樺脂醇作用于人胃癌MGC-803細(xì)胞后，細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著降低，Ki67和PCNA表達水平顯著降低。Ki67和PCNA表達水平與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，是檢測腫瘤細(xì)胞增殖能力的可靠指標(biāo)，提示白樺脂醇抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖。

在正常生理條件下，細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡共同影響細(xì)胞數(shù)目，維持機體穩(wěn)態(tài)。腫瘤細(xì)胞周期失常會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞快速增殖，且腫瘤細(xì)胞凋亡受到抑制，兩者共同造成腫瘤細(xì)胞無限增殖。Shtilman等[12]用白樺脂醇與金屬納米顆粒聯(lián)合處理正常細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞，白樺脂醇對黑色素瘤的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用呈劑量依賴性。本文研究顯示，不同濃度白樺脂醇處理MGC-803細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡比率顯著增加，且其變化呈劑量依賴性。細(xì)胞凋亡通常由激活半胱氨酸蛋白酶caspase而誘發(fā)。Zhou等[13]研究發(fā)現(xiàn)，白樺脂醇能促進結(jié)直腸癌中NOXA蛋白表達，促進細(xì)胞色素C釋放，上調(diào)caspase-9和caspase-3表達，誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果與之類似，白樺脂醇處理人胃癌MGC-803細(xì)胞后，細(xì)胞中Bax、Cleaved caspase-9和Cleaved caspase-3表達水平顯著升高。當(dāng)細(xì)胞色素C與Apaf-1和前體caspase-9結(jié)合，使細(xì)胞中活性氧含量顯著增加，線粒體膜電位降低，從而酶切caspase-9前體?；罨腸aspase-9又可通過酶切caspase-3前體使其活化?；罨腸aspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，能降解DNA復(fù)制相關(guān)蛋白、凋亡抑制蛋白及細(xì)胞骨架蛋白等，促使細(xì)胞凋亡不可逆地進行。Mihoub等[14]指出，白樺脂醇通過干擾線粒體呼吸鏈影響肺癌細(xì)胞生長和凋亡。白樺脂醇誘導(dǎo)人胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡。

PIK3/AKT通路參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT通路活性的增加與多種癌癥密切相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度白樺脂醇作用于MGC-803細(xì)胞后，細(xì)胞中PI3K和p-AKT表達水平顯著降低。PI3K被激活后，通過一系列反應(yīng)磷酸化激活A(yù)KT，AKT能促進凋亡抑制蛋白Bcl-2表達。Bax蛋白與Bcl-2結(jié)合形成復(fù)合體，能促進Bcl-2降解，解除Bcl-2對細(xì)胞凋亡的抑制作用。Bcl-2及Bax的表達調(diào)控細(xì)胞色素C的釋放，進而影響細(xì)胞凋亡[16,17]。Jing等[18]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過PTEN調(diào)控PI3K/AKT信號通路，誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞周期阻滯。Tao等[19]的實驗也證實，抑制PI3K/AKT通路后，MGC-803細(xì)胞增殖受到抑制，而細(xì)胞凋亡增加。本研究表明，白樺脂醇抑制MGC-803細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機制可能與PI3K/AKT通路的抑制相關(guān)。

綜上，不同濃度白樺脂醇處理人胃癌MGC-803細(xì)胞后，細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著降低，Ki67和PCNA表達水平顯著降低，發(fā)生凋亡的細(xì)胞比率顯著增加，Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達水平顯著升高，提示白樺脂醇誘導(dǎo)人胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。但白樺脂醇對人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖和凋亡產(chǎn)生影響的分子機制，以及動物實驗中能否產(chǎn)生相同的作用仍需進一步研究。