張曉文 鄭思琪 馬應(yīng)卓 李 帆 李娟芳 (商洛學(xué)院，商洛 726000)

藥物誘導(dǎo)的肝損傷是指通過某些藥物或其代謝物誘導(dǎo)的急性或慢性肝損傷，如今，藥物性肝損傷已成為急性肝損傷的最常見原因，也導(dǎo)致了藥物不良反應(yīng)[1]。嚴(yán)重的肝損傷可能導(dǎo)致肝功能衰竭甚至危及生命，因此，針對藥物性肝損傷尋找一種效果顯著且安全的藥物是十分重要的。對乙酰氨基酚(paracetamol，APAP)常用做解熱鎮(zhèn)痛藥，當(dāng)以治療劑量使用時，它是安全有效的，然而，由于過度使用APAP，實驗動物和人類均可誘發(fā)嚴(yán)重的肝損傷[2]。由于其常見和實驗簡單，目前廣泛用于臨床建立藥物性肝損傷動物模型[3]。洋薊素又稱朝薊素，洋薊酸，是提取自中藥菜薊的一類咖啡酰奎寧酸類化合物，具有抗氧化、抗微生物、利膽和保肝作用[4]。其利膽和保肝作用通常與洋薊素的含量有關(guān)[5]。目前尚未有研究發(fā)現(xiàn)關(guān)于洋薊素對藥物性肝損傷是否具有治療作用。本文旨在研究洋薊素對APAP誘導(dǎo)的大鼠藥物性肝損傷的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 60只SD大鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，雄性，12周齡，體質(zhì)量(200±10)g，許可證號：SCXK(粵)2018-0002，置于溫控(22±1)℃和光控(200 lux，12 h光暗循環(huán))動物設(shè)施中常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.1.2藥物與主要試劑 洋薊素購自美國Sigma-Aldrich，化學(xué)式：C25H24O12，分子量：516.45，純度≥98.0%；APAP購自中國食品藥品檢定研究院；N-乙酰半胱氨酸購自上海晶都生物技術(shù)有限公司；蘇木素伊紅染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測試盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測試盒、堿性磷酸酶測定試劑盒、一氧化氮測定試劑盒、總超氧化物歧化酶測定試劑盒、丙二醛測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶均購自南京建成生物工程研究所；IL-6、TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒均購自美國Abcam公司。

1.1.3儀器 酶標(biāo)儀(318C+)購自上海沛歐分析儀器有限公司；可見分光光度計(V-1500PC)購自上海添時科學(xué)儀器有限公司；熒光顯微鏡(DYF-680)購自上海點應(yīng)光學(xué)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立和分組 將大鼠隨機(jī)分為6組：對照組(Control)、模型組(Model)、洋薊素低劑量組(Cynarin 50)、洋薊素中劑量組(Cynarin 100)、洋薊素高劑量組(Cynarin 150)、N-乙酰半胱氨酸組(N-NAC)。洋薊素組尾靜脈注射APAP300 mg/kg，每日灌服洋薊素10 ml(50、100、150 mg/kg)或N-乙酰半胱氨酸(100 mg/kg)，連續(xù)28 d。Model組尾靜脈注射APAP(300 mg/kg)，每日灌服生理鹽水。Control組尾靜脈注射生理鹽水(300 mg/kg)，每日灌服等量生理鹽水[6]。

1.2.2肝重/體重比 模型建立后，稱量各組大鼠體重，記為大鼠初始體重，模型建立28 d后，稱量各組大鼠體重，記為終末體重，計算大鼠增重。處死大鼠，取肝組織稱重，計算肝重/體重比。

1.2.3HE染色 將肝組織用10%福爾馬林固定并進(jìn)行石蠟包埋切片，蘇木素伊紅染色，將石蠟切片脫蠟，蒸餾水潤濕組織，核染液染色5 min，水洗 5 s，漿染液染色30 s，水洗后，濾紙吸干，無水乙醇脫水2次后封片，在熒光顯微鏡下觀測。并參照文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行肝損傷病理評分。

1.2.4血清中ALT、AST、AKP和NO測定 按照試劑盒說明書，采用酶標(biāo)儀測定血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)、一氧化氮(NO)水平。ALT、AST在510 nm 處測OD值，AKP在520 nm處測OD值，NO在550 nm處測OD值。

1.2.5ELISA 在4℃下用50 mmol/L的碳酸鹽包被緩沖液溶解抗原，100 μl/孔置96 孔酶標(biāo)板，將抗原包被過夜，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次5 min，每孔加150 μl 1%BSA封閉1 h，PBST洗滌3次，加入100 μl不同稀釋度的血清，并加入對照樣品，37 ℃孵育2 h，PBST洗滌5次，加入100 μl稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，PBST洗滌5次后顯色劑顯色20 min，用酶標(biāo)儀測定。

1.2.6肝勻漿中SOD、MDA和GSH測定 按照試劑盒說明書，采用酶標(biāo)儀測定總超氧化物歧化酶(SOD)含量，采用可見分光光度計測定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)含量。SOD在450 nm處測OD值，MDA在532 nm處測OD值，GSH在412 nm處測OD值。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 使用統(tǒng)計軟件SPSS17.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布分析和方差齊性分析，符合條件的選用單因素方差分析或t檢驗，不符合條件的選用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1洋薊素降低大鼠肝重/體重比 檢測各組大鼠體重和肝重結(jié)果如表1所示。Model組終末體重顯著高于Control組(P<0.05)，Cynarin 50、100、150組和N-NAC組終末體重均顯著高于Model組(P<0.05)；Model組體重增量顯著低于Control組(P<0.05)，Cynarin 50、100、150組和N-NAC組體重增量顯著高于Model組(P<0.05)；Model組肝重顯著高于Control組(P<0.05)。Model組肝重/體重比顯著高于Control組(P<0.05)，Cynarin 50、100、150組和N-NAC組肝重/體重比均顯著低于Model組(P<0.05)。

表1 各組大鼠體重和肝重測定結(jié)果

2.2洋薊素改善大鼠肝組織病理損傷 HE染色檢測各組大鼠肝組織病理損傷結(jié)果如圖1所示，與Control組相比，Model組肝組織肝索紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤，細(xì)胞空泡樣變性，病理損傷評分顯著升高(P<0.05，表2)。Cynarin 50、100、150組和N-NAC組病理損傷程度較Model組有所減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少，空泡樣變性減少，病理損傷評分顯著降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠肝組織損傷病理評分

圖1 HE染色

2.3洋薊素降低血清中AST、ALT、AKP、NO水平 與Control組相比，Model組血清中AST、ALT、AKP、NO水平顯著降低(P<0.05)，Cynarin 50、100、150組和N-NAC組血清中AST、ALT、AKP、NO水平均顯著低于Model組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中的各項指標(biāo)測定結(jié)果

2.4洋薊素下調(diào)血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平 Model組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著高于Control組(P<0.05)，Cynarin 50、100、150組和N-NAC組TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著低于Model組(P<0.05)。見表4。

表4 血清炎癥因子水平

2.5洋薊素對大鼠肝組織中SOD、GSH、MDA含量的影響 與Control組相比較，Model組SOD、GSH顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)。與Model組相比較，Cynarin 50、100、150組和N-NAC組SOD、GSH含量顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。見表5。

3 討論

藥物性肝損傷是指由各種處方藥或非處方藥誘發(fā)的肝損傷，包括小分子化學(xué)藥物、生物制劑、中藥、天然藥物、保健品和膳食補(bǔ)充劑等[8]。目前對藥物性肝損傷仍缺乏簡便、客觀、特異的診斷指標(biāo)和特異的治療方法。APAP是研究最多的藥物之一，導(dǎo)致可預(yù)測的藥物性肝損傷，其肝毒性呈劑量依賴性[9]。到目前為止，N-NAC是治療APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷最重要的療法。然而，如果不及時治療，患者通常需要進(jìn)行肝移植[10]。已有研究證明洋薊素具有保肝活性，本文研究發(fā)現(xiàn)，洋薊素可降低大鼠肝組織病理損傷程度，降低大鼠肝重/體重比。

藥物性肝損傷一般表現(xiàn)為肝臟生化指標(biāo)水平升高，血清中ALT、AST、AKP屬于藥物性肝損傷的生物標(biāo)志物[11]。NO是肝細(xì)胞氧化還原生物學(xué)中至關(guān)重要的活性氮物種，在APAP中毒時，肝組織中NO的合成增加[12]。Huang等[13]研究發(fā)現(xiàn)金絲小棗通過降低AST，ALT和AKP水平保持肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性并減輕APAP誘導(dǎo)的肝損傷。尹學(xué)哲等[14]研究發(fā)現(xiàn)草蓯蓉不同溶劑萃取物通過降低一氧化氮合酶活性和NO水平對APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷發(fā)揮保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，洋薊素可降低AST、ALT、AKP水平的作用。

在APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷下，活化的肝巨噬細(xì)胞將釋放各種促炎細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL6和IL-1β，這些促炎細(xì)胞因子能增強(qiáng)炎癥反應(yīng)和增加免疫細(xì)胞，如單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的流入[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，洋薊素可降低TNF-α、IL6和IL-1β水平。

過量的乙酰氨基酚轉(zhuǎn)化為NAPQI后，與組織大分子共價結(jié)合并氧化脂質(zhì)，導(dǎo)致肝毒性，而脂質(zhì)過氧化會導(dǎo)致膜破裂，導(dǎo)致膜完整性喪失和微粒體酶滲漏。GSH在線粒體抗氧化防御中起關(guān)鍵作用，且NAPQI誘導(dǎo)的耗竭是APAP誘導(dǎo)的毒性中的重要事件。MDA是脂質(zhì)過氧的終產(chǎn)物通常用作氧化應(yīng)激的生物指示劑，SOD是保護(hù)活性氧反應(yīng)的重要酶，在APAP誘導(dǎo)期間，SOD活性較低[16]。Yan等[17]研究發(fā)現(xiàn)膳食α-Mangostin通過增加GSH含量，降低MDA含量對APAP誘導(dǎo)的肝毒性具有保護(hù)作用。Liu等[18]研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧乙醇提取物通過增加GSH水平、SOD活性，降低MDA含量改善對APAP誘導(dǎo)的肝損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，洋薊素有增加SOD、GSH含量，降低MDA含量的作用。

綜上所述，在對APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷中，洋薊素可改善肝組織病理損傷程度，降低肝臟生化指標(biāo)水平、血清炎癥因子水平，改善氧化應(yīng)激水平。本文研究結(jié)果闡明了洋薊素治療藥物性肝損傷的潛力，但具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步實驗研究。