姚宗花 張先娟 郭敬敬 劉美艷 張麗麗 (濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，濱州 256603)

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，位居世界女性惡性腫瘤第三，全球每年發(fā)病人數(shù)約為50萬，死亡率高達50%，主要發(fā)生于亞洲[1]。目前宮頸癌治療仍以手術、放療、化療等為主，但不良反應發(fā)生率較高，嚴重影響患者身心健康[2，3]。因此，急需繼續(xù)尋找宮頸癌的有效治療策略。姜黃屬植物是廣泛應用于亞洲國家的抗腫瘤藥物，其主要成分為吉馬酮(gemmarone，GMC)，具有抗腫瘤、抑制脂肪形成、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[4,5]。GMC是單環(huán)倍半萜類化合物,具有倍半萜類化合物共有的特性，近年關于GMC的藥理作用研究越來越廣泛[6-8]。GMC具有抗腫瘤作用，可抑制肝癌、肺癌等癌癥細胞增殖并誘導細胞凋亡，且可直接殺傷腫瘤細胞，但其對宮頸癌的作用鮮有報道。由于宮頸癌細胞增殖、自噬能力不足和凋亡機制失調(diào)，導致宮頸癌患者預后較差[9，10]。因此，尋找抑制增殖、促進凋亡和自噬的有效靶向抗癌劑對宮頸癌患者具有重要意義。本文旨在研究GMC對宮頸癌Hela細胞自噬和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗藥物和試劑 GMC購自美國Sigma-Aldrich (42924)；Dulbecco′s modified Eagle′s medium培養(yǎng)基(12002-090)、胰蛋白酶(27254-019)胰蛋白酶(25200-056)和青-鏈霉素(15140-122)購自GIBCO BRL公司；AMPK抑制劑AICAR (A8184)購自美國APExBIO生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自Dojindo公司(KH668)；AnnexinV/PI雙染試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展公司(KGI106)；Anti-Ki67(ab15580)和Anti-Caspase-3(ab13585)均購自Abcam公司；BCA試劑盒購自碧云天生物技術研究所(P001S)；抗Beclin 1(sc54782)、 P62(sc58241)、 LC3Ⅰ/Ⅱ(sc47821)購自Santacruz公司；免疫熒光試劑盒購自上海優(yōu)予生物科技有限公司(KGIF002)。

1.1.2細胞來源 ECT1/E6E7人宮頸永生化鱗狀細胞與人宮頸癌Hela細胞來源于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 取對數(shù)長生長期Hela細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L鏈霉素)，5% CO2、37℃培養(yǎng)。培養(yǎng)基每2 d更換1次，平均3～4 d傳代1次。

1.2.2細胞處理與分組 人宮頸永生化鱗狀細胞ECT1/E6E7和宮頸癌Hela細胞用不同濃度的GMC(0、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500 μmol/L)處理48 h。CCK-8試劑盒檢測細胞存活率，根據(jù)存活能力選擇無細胞毒性的宮頸癌Hela細胞進行后續(xù)實驗。宮頸癌Hela細胞分為4組：對照組(0 μmol/L)、GMC低濃度組(5 μmol/L)、GMC中濃度組(10 μmol/L)、GMC高濃度組(20 μmol/L)。

1.2.3CCK-8檢測細胞增殖 參考文獻[7]，各組細胞處理后，連續(xù)培養(yǎng)宮頸癌Hela細胞4 d，每 d檢測各組細胞數(shù)量，繪制增殖倍數(shù)曲線。用培養(yǎng)基將CCK-8溶液稀釋至10%，制成1×106個/ml的細胞懸液，37℃培養(yǎng)1～4 h，450 nm處檢測吸光度，計算細胞增殖倍數(shù)。

1.2.4細胞凋亡檢測 參考文獻[11]，收集懸浮細胞至10 ml離心管，3×106ml/孔，500～1 000 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)液，孵育緩沖液洗滌1次，500～1 000 r/min 離心5 min，用100 μl的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10～15 min，500～1 000 r/min離心5 min，沉淀細胞孵育緩沖液洗1次，加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃孵育20 min，避光振動，流式細胞儀分析，激發(fā)光波長488 nm，用波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，波長大于560 nm的濾器檢測PI。

1.2.5Western blot 參考文獻[12]，收集各組細胞冰上溶解25 min。12 000 r/min離心10 min，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白含量。提取等量蛋白樣品(20 mg)，100℃變性5 min。SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉移至PVDF膜，4℃加入相應一抗孵育過夜，清洗，4℃加入辣根過氧化物酶標記的二抗，孵育2 h，加入發(fā)光液曝光處理，ImageJ軟件統(tǒng)計灰度值。

1.2.6免疫熒光檢測LC3含量 爬片置于12孔板，以2×104個/孔將細胞接種于爬片。Control、GMC-L、GMC-M、GMC-H組干預宮頸癌Hela細胞4 h，免疫熒光法檢測LC3蛋白免疫熒光。

2 結果

2.1人宮頸正常細胞ECT1/E6E7和宮頸癌Hela細胞生存能力比較 人宮頸正常細胞ECT1/E6E7在各濃度GMC處理下細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，宮頸癌Hela細胞隨GMC濃度升高，存活率降低(P<0.01)。見圖1。

2.2GMC抑制宮頸癌Hela細胞增殖 與對照組相比，GMC-L組、GMC-M組、GMC-H組細胞增殖倍數(shù)依次降低，GMC濃度越高，細胞增殖倍數(shù)越低(P<0.01)，見圖2；處理時間越長，增殖能力越低。說明GMC以劑量依賴和時間依賴的方式抑制宮頸癌Hela細胞增殖。

圖2 GMC對宮頸癌Hela細胞增殖的影響

2.3GMC促進宮頸癌Hela細胞凋亡 與對照組相比，GMC各細胞處理組凋亡率依次升高(P<0.01)；細胞增殖標記Ki67表達隨GMC濃度升高而降低，Caspase-3表達隨GMC濃度升高而升高。說明GMC以濃度依賴方式促進宮頸癌Hela細胞凋亡，見圖3。

圖3 GMC對宮頸癌Hela細胞凋亡的影響

2.4GMC促進宮頸癌Hela細胞自噬 GMC可顯著下調(diào)P62蛋白水平，上調(diào)Beclin 1和LC3Ⅱ蛋白水平(P<0.01)，且呈劑量依賴性。GMC可促進自噬。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加，說明LC3Ⅰ轉換為LC3Ⅱ，提示GMC可提高自噬通量。GMC濃度越高，LC3含量越高(P<0.01)，表明GMC可能通過增加自噬標記物LC3含量促進宮頸癌Hela細胞自噬，見圖4。

圖4 GMC對宮頸癌Hela細胞自噬的影響

2.5GMC激活AMPK信號通路 與對照組相比，處理組AMPK激活水平明顯升高(P<0.01)，且呈劑量依賴性，加入AMPK抑制劑的各處理組AMPK激活水平明顯低于細胞處理組。與AICAR組相比，GMC-H+AICAR組AMPK激活水平顯著升高(P<0.01)，說明GMC通過激活AMPK信號通路調(diào)節(jié)細胞能量代謝，見圖5。

圖5 GMC對AMPK信號通路的影響

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤，2015年27萬宮頸癌死亡病例中，約90%發(fā)生在低收入和中等收入國家，是發(fā)達國家的18倍[13]。人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的2種高危亞型幾乎導致了所有宮頸癌，目前HPV篩查和疫苗接種是預防該疾病的有效策略。目前宮頸癌主要治療手段為化學治療，效果良好，但腫瘤復發(fā)和轉移仍然是宮頸癌患者死亡的主要原因[14]。因此，研究宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程、尋找新的治療靶點已成為宮頸癌研究重點[15]。

本研究選用的天然化合物GMC是從傳統(tǒng)中藥姜黃根莖中提取的天然化學成分，具有抗病毒、抗炎、抗菌等藥理作用[16]。藥理研究發(fā)現(xiàn)，GMC具有明顯的抗腫瘤作用，可抑制肝癌細胞、乳腺癌細胞、膠質(zhì)瘤細胞等腫瘤細胞生長，且低毒、高效[17，18]。GMC可降低人非小細胞肺癌NCI-H1770細胞增殖、侵襲及遷移,促進細胞凋亡[19]。GMC可促進肝癌細胞凋亡，抑制肝癌細胞增殖，且呈劑量依賴性，可單獨或聯(lián)合用于肝癌治療和預防[8]。Liu等[20]研究發(fā)現(xiàn)GMC可通過抑制JAK2/STAT3信號通路誘導人肝癌HepG2細胞凋亡；Zhong等[7]研究發(fā)現(xiàn)GMC與阿霉素(MDR)具有協(xié)同作用，增強乳腺癌細胞增殖。GMC可調(diào)節(jié)膠質(zhì)腦瘤細胞凋亡和G1期阻滯相關蛋白表達影響其增殖，與本實驗結果一致[21]。本研究發(fā)現(xiàn)GMC可抑制宮頸癌Hela細胞凋亡。

自噬是細胞生理機制，具有維持細胞自我穩(wěn)態(tài)、促進細胞生存的作用，自噬能力下降與宮頸癌發(fā)生密切相關[22,23]。研究表明，可通過誘導自噬降低HPV病毒載量，證明自噬可誘發(fā)癌癥，也可抑制癌癥[24]。因此，通過刺激自噬阻止損傷的發(fā)生并最終抑制腫瘤發(fā)生[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，GMC可顯著誘導自噬，表現(xiàn)為抑制Beclin 1和LC3-Ⅱ表達，促進P62表達，以劑量依賴方式促進細胞自噬。

AMPK是細胞能量傳感器和營養(yǎng)通路激活的主要成分，可調(diào)節(jié)細胞增殖、生長和自噬[26]。腫瘤抑制基因LKB1可激活AMPK,而另一種腫瘤抑制基因TSC2 是AMPK的下游效應因子[27]。AMPK可作為宮頸癌治療的潛在靶點。AMPK激活劑AICAR作為有效的抗腫瘤藥物廣泛應用于LKB1突變和缺失的癌癥。Chen等[28]研究發(fā)現(xiàn)異丙酚通過抑制自噬通量抑制宮頸癌Hela細胞生長，其機制為激活AMPK和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。本研究結果表明，GMC作用于宮頸癌Hela細胞后可上調(diào)AMPK，但具體機制有待進一步研究。

本研究提示GMC可激活AMPK通路誘導宮頸癌Hela細胞自噬和凋亡。GMC可抑制宮頸癌Hela細胞增殖，促進其凋亡，促進自噬，提高LC3自噬標記物含量，可能通過激活AMPK信號通路實現(xiàn)。本研究結果可為GMC臨床治療宮頸癌提供依據(jù)。