文艷梅 梁宗安 徐治波 茍冶然 鄧正旭 (成都市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，成都 610017)

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，死亡率極高，發(fā)病率居男性腫瘤第1位,居女性腫瘤第2位，5年生存率較低，給患者和社會(huì)造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[1-3]。盡管初始治療效果良好，但小細(xì)胞肺癌通常在1年內(nèi)復(fù)發(fā)，并對(duì)多種藥物耐藥[4]。因此，需要尋找新的策略改善晚期不可切除、轉(zhuǎn)移性肺癌患者的生存率和生活質(zhì)量。PI3K/AKT通路是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵信號(hào)通路，該通路的激活能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力[5]。近年來(lái)，天然提取物備受關(guān)注，廣泛用于癌癥治療的輔助治療。淫羊藿是廣泛分布于我國(guó)西南和中部地區(qū)的植物，亦分布于亞洲、中東和歐洲等溫帶和亞熱帶地區(qū)，其主要活性成分為淫羊藿苷，在抗腫瘤中的潛在作用已被逐漸熟知，如對(duì)食管癌、肝癌、乳腺癌、成神經(jīng)管細(xì)胞癌等多種癌癥均具有抵抗作用[6-8]。因此，本文以肺腺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，探討淫羊藿苷對(duì)體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移特性的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系與試劑 人肺腺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自北京中科院腫瘤細(xì)胞庫(kù)；淫羊藿苷(純度≥98%)購(gòu)自上海純優(yōu)生物科技有限公司；CCK8試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；BCA試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技公司；單抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)自Santa Cruze公司；RIPA裂解液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Transwell小室購(gòu)自北京優(yōu)尼康生物技術(shù)有限公司；Matrix基質(zhì)膠購(gòu)自BD公司。

1.1.2儀器 CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)ThermoForma公司；PCR儀、電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；Gel View 6000化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自廣州云星儀器有限公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州中亞凈化設(shè)備有限公司；普通光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基懸浮肺腺癌A549細(xì)胞，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行消化傳代。

1.2.2CCK8實(shí)驗(yàn) 將上述A549細(xì)胞懸液接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，隨機(jī)分為0、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、20、50、100、200、300和400 μmol/L組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，10 μl/孔加入CCK8溶液，繼續(xù)孵育4 h，450 nm處檢測(cè)A549細(xì)胞存活率。根據(jù)細(xì)胞存活率結(jié)果，選擇無(wú)明顯細(xì)胞毒性的最大濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn) 12孔板背面用記號(hào)筆劃5條平行直線，高溫滅菌后備用。A549細(xì)胞以1×105個(gè)/ml接種于12孔板。細(xì)胞貼壁后，用10 μl槍頭垂直于培養(yǎng)板背面的橫線劃痕，PBS清洗3次，根據(jù)細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：Ctrl組、Icariin (10 μmol/L)組、Icariin (20 μmol/L)和Icariin(50 μmol/L)組，給予對(duì)應(yīng)濃度藥液處理后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨機(jī)選取5個(gè)視野，檢測(cè)細(xì)胞遷移情況。

1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn) 提前用Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室上層，將A549細(xì)胞傳代接種于小室上層，用不含胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，下層加入正常細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，無(wú)菌拭去Matrigel基質(zhì)膠和小室上層細(xì)胞，洗滌后用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，流水沖洗并晾干。顯微鏡下每組隨機(jī)選取5個(gè)視野對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。至少重復(fù)3次，每組6個(gè)復(fù)孔。

1.2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞傳代接種于6孔板，1 ml/孔，培養(yǎng)24 h后，分組同1.2.3，加入不同濃度淫羊藿苷，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞。用添加蛋白抑制劑的RIPA蛋白裂解液于冰上裂解，提取總蛋白，4℃離心收集，取上清，BCA試劑盒定量。每組取等量蛋白質(zhì)用12% SDS-PAGE分離蛋白后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜。棄去一抗，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。滴加ECL于暗室曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1淫羊藿苷對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響 與Ctrl組相比，100 μmol/L及以上濃度淫羊藿苷處理細(xì)胞，存活率顯著降低(P<0.05，圖1)，且呈劑量依賴性，100 μmol/L及以下濃度組細(xì)胞存活率與Ctrl組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明淫羊藿苷能降低人肺腺癌細(xì)胞A549存活率，當(dāng)終濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)出現(xiàn)明顯細(xì)胞毒性作用。因此采用無(wú)細(xì)胞毒性的3個(gè)最大濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，即10、20和50 μmol/L。

圖1 淫羊藿對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

2.2淫羊藿苷對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響 與Ctrl組相比，淫羊藿苷各劑量組細(xì)胞凋亡率均呈上升趨勢(shì)(P<0.05，圖2)，且呈劑量依賴性。

圖2 淫羊藿對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

2.3淫羊藿苷對(duì)A549細(xì)胞侵襲遷移能力的影響 與Ctrl組相比，淫羊藿苷各劑量組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，且呈劑量依賴性。劃痕愈合率明顯下降(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見圖3。提示淫羊藿苷可劑量依賴性地降低A549細(xì)胞侵襲遷移能力。

圖3 淫羊藿對(duì)A549細(xì)胞侵襲遷移能力的影響

2.4淫羊藿苷對(duì)A549細(xì)胞EMT的影響 與Ctrl組相比，10、20和50 μmol/L Icariin組E-cadherin (上皮標(biāo)記蛋白)表達(dá)隨淫羊藿苷濃度增大而逐漸提高(P<0.05)，而間質(zhì)標(biāo)記蛋白(N-cadherin)和Vimentin(波形蛋白)表達(dá)呈劑量依賴性下調(diào)(P<0.05，圖4)。提示淫羊藿苷可劑量依賴性地抑制體外培養(yǎng)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

圖4 淫羊藿對(duì)A549細(xì)胞EMT的影響

2.5淫羊藿苷對(duì)A549細(xì)胞PI3K、AKT磷酸化的影響 與Ctrl組相比，Icariin 10 、20和50 μmol/L組PI3K、AKT磷酸化水平均明顯降低(P<0.05，圖5)，且呈劑量依賴性。

圖5 淫羊藿對(duì)A549細(xì)胞PI3K、AKT磷酸化的影響

2.6淫羊藿、740Y-P單獨(dú)/聯(lián)合使用對(duì)A549細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響 與Ctrl組相比，兩者單用時(shí)可分別提高或降低A549細(xì)胞凋亡率(P<0.05，圖6A)，聯(lián)合使用時(shí)，細(xì)胞凋亡率比740Y-P單獨(dú)使用時(shí)明顯上調(diào)(P<0.05,圖6A)，50 μmol/L淫羊藿苷或740Y-P可顯著降低或提高細(xì)胞增殖水平、侵襲細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率(P<0.05，圖6B～D)，以上指標(biāo)在兩者聯(lián)用時(shí)比單用740Y-P時(shí)明顯下調(diào)(P<0.05)；50 μmol/L淫羊藿苷能明顯下調(diào)PI3K/AKT磷酸化水平，而740Y-P則能上調(diào)PI3K/AKT磷酸化水平，兩者聯(lián)用能明顯抑制740Y-P單用時(shí)對(duì)PI3K/AKT磷酸化的上調(diào)作用(P<0.05，圖6E～G)。提示淫羊藿苷可有效逆轉(zhuǎn)PI3K激活劑740Y-P對(duì)A549細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響。

圖6 淫羊藿苷與740-YP單獨(dú)/聯(lián)合使用對(duì)A549細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響

3 討論

肺癌的發(fā)生是異常復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種分子、細(xì)胞因子、基因等，其中信號(hào)通路是近年研究熱點(diǎn)之一。淫羊藿具有廣泛的生物活性，可單獨(dú)或聯(lián)合用于骨質(zhì)疏松癥治療、性功能障礙、高血壓和炎癥性疾病(如慢性阻塞性肺疾病)[9-13]。淫羊藿是抗腫瘤的潛在藥物，能通過(guò)抑制多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥微環(huán)境，從而表現(xiàn)出多種癌細(xì)胞毒性，如在小鼠肝癌和白血病腫瘤模型中對(duì)體內(nèi)和體外的癌細(xì)胞系均具有抑制作用[14]。因此，淫羊藿單獨(dú)或與化療藥物聯(lián)合使用可能是癌癥的有效干預(yù)方法，可加強(qiáng)治療效果和避免耐藥性[7]。

抑制腫瘤細(xì)胞增殖速度是抗癌藥發(fā)揮作用的重要方向。研究表明，植物提取物淫羊藿苷作用于體外培養(yǎng)的人卵巢癌細(xì)胞SKOV3和多藥耐藥細(xì)胞SKVCR細(xì)胞時(shí)，可劑量依賴性抑制其增殖能力[15]。髓母細(xì)胞瘤是兒童最常見的腦惡性腫瘤，Sun等[16]研究表明，淫羊藿苷通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞S期阻滯抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖。作為淫羊藿另一活性成分淫羊藿苷Ⅱ也能通過(guò)ROS/p38/p53途徑抑制人黑色素瘤A375細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，且呈濃度和時(shí)間依賴性地降低肝癌HepG2細(xì)胞存活率，抑制肝癌移植瘤小鼠腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[17,18]。本研究也表明，100 μmol/L淫羊藿苷對(duì)A549細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，在10、20和50 μmol/L濃度范圍內(nèi)，可顯著降低體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞存活率，影響A549細(xì)胞增殖能力。

促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡也是抗癌藥物發(fā)揮抗癌作用的機(jī)制之一。研究表明，淫羊藿苷能通過(guò)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制急性早幼粒細(xì)胞白血病、卵巢癌、B16黑色素瘤進(jìn)程，與本研究結(jié)果即淫羊藿苷能顯著提高A549細(xì)胞凋亡水平相似[19-21]。

藥物發(fā)揮抗癌作用時(shí)可抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移。研究表明，淫羊藿苷能影響食管癌EC109和TE1、胃腺癌BGC-823細(xì)胞黏附和轉(zhuǎn)移。淫羊藿苷Ⅱ可上調(diào)N-cadherin、vimentin表達(dá)和下調(diào)E-cadherin表達(dá)，從而抑制肺癌A549和H1299細(xì)胞遷移和EMT[24]。本研究結(jié)果證明，10、20和50 μmol/L淫羊藿苷均能降低體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞的侵襲遷移能力，且呈劑量依賴性，其機(jī)制與上調(diào)E-cadherin、下調(diào)N-cadherin和Vimentin表達(dá)相關(guān)。

PI3K隸屬于磷脂激酶家族，機(jī)體內(nèi)多種因子均能激活PI3K，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種信號(hào)傳導(dǎo)[25]。研究表明，該通路的異常激活與多種功能性疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如慢性阻塞性肺疾病、卵巢癌、宮頸癌和肝癌等[26-29]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)高表達(dá)激活PI3K/AKT通路而上調(diào)炎癥因子表達(dá)，從而可加重慢性阻塞性肺疾病的病理學(xué)改變情況。為證明淫羊藿苷抑制體外培養(yǎng)的人肺腺癌A549細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移特性與PI3K/AKT信號(hào)通路的相關(guān)，本研究檢測(cè)了通路蛋白的磷酸化水平，并考察了PI3K激活劑740-YP對(duì)A549細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響，結(jié)果表明，淫羊藿苷能顯著下調(diào)PI3K/AKT通路蛋白的磷酸化水平，有效逆轉(zhuǎn)740-YP對(duì)A549細(xì)胞的作用。

本研究探討了淫羊藿苷在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)A549腫瘤細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制，證明淫羊藿苷可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路降低肺腺癌A549細(xì)胞的存活率和轉(zhuǎn)移特性。