符垂師 云 川 馮業(yè)成 黃 天 (海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，海口 570102)

嬰幼兒血管瘤(infantile hemangioma，IH) 是嬰幼兒最常見良性腫瘤，由中胚葉血管內(nèi)皮細(xì)胞過度增殖所致[1]。IH通常發(fā)病于嬰幼兒出生或出生后 3～6 個(gè)月內(nèi)，發(fā)病率約為3%～10%，發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前治療手段主要為廣泛性冷凍、放射療法及口服類固醇類藥物等，多種新治療手段如干擾素、硬化劑、激光等也可用于IH治療，但副作用較大[2]。姜黃素是從姜黃中提取的酚類色素，具有多種藥理作用，其抗腫瘤作用不僅與抗腫瘤血管生成有關(guān)，還可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[3]。目前姜黃素用于嬰幼兒IH治療的作用及機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究旨在探討姜黃素對(duì)HemECs增殖、凋亡的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器 姜黃素購自美國 Sigma公司;HIF-1α、VEGF抗體購自美國 Santa Cruz公司；Trio(A4902-1)購自美國 Invitrogen公司；兔抗人Ⅷ因子、CD31、CD34抗體購自武漢博士德公司；MCL-1、cl-Caspase-3和cl-PARP抗體及其二抗購于Santa Cruz 公司；Annexin Ⅴ/FITC凋亡檢測試劑盒購自美國 Qbiogene 公司；RT-qPCR試劑盒購自日本 TaKaRa公司；Trizol 購自Invitrogen公司；Real-time PCR儀購自美國ABI公司；CO2培養(yǎng)箱購自美國 Thermo Scientific公司；FASCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；熒光顯微鏡購自德國Zeis公司；ELX800UV 酶標(biāo)儀購自美國 Bio-Tek 公司。

1.1.2組織來源 1例IH組織標(biāo)本來源于我院小兒外科，3個(gè)月齡，男性，家屬知情同意。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 參照文獻(xiàn)[4]，取新鮮IH標(biāo)本，剪成1～2 cm3組織塊，酶消化法分離培養(yǎng)HemECs。將消化后的組織塊剪碎至約1 mm3，接種于培養(yǎng)皿(1%明膠包被)，加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基)，37℃、5%CO2孵育。免疫熒光法鑒定 HemECs特異性表面標(biāo)志物Ⅷ因子、CD31和CD34。

1.2.2CCK-8檢測HemECs增殖 將HemECs接種于96孔培養(yǎng)板(3 000個(gè)/孔)，孵育過夜，加入含不同濃度姜黃素(12.5、25、50、100 μmol/L)的培養(yǎng)液或DMSO(對(duì)照)培養(yǎng)液作用48 h，加入CCK-8試劑0.01 ml，孵育 4 h，取出后于酶標(biāo)儀450 nm處測定各孔吸光度(A)。

1.2.3臺(tái)盼藍(lán)法染色 取各組細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)2 h后棄上清，PBS清洗，加0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液20 μl，靜置2 min，吸去染液，PBS清洗，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色呈藍(lán)色為死細(xì)胞。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將HemECs接種于培養(yǎng)皿，加入含25 μmol/L姜黃素或DMSO(對(duì)照)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5 min，Annexin V-FITC/PI試劑盒染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5電鏡觀察凋亡細(xì)胞 將HemECs接種于培養(yǎng)皿，加入25 μmol/L姜黃素或DMSO(對(duì)照)培養(yǎng)48 h，5 000 r/min離心20 min，棄上清，加入500 μl戊二醛固定，透射電鏡觀察。

1.2.6免疫熒光分析 參考文獻(xiàn)[5]，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為2×104/ml，加入25 μmol/L姜黃素或DMSO(對(duì)照)作用24 h后，PBS清洗，4%多聚甲醛室溫固定，0.5% Tritonx-100室溫作用10 min；3%H2O2室溫作用20 min，羊血清室溫封閉30 min，加入一抗4℃孵育過夜，PBS清洗，加入熒光標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，滴加終濃度為5 mg/L加入DAPI，避光染色，封片，熒光顯微鏡下檢測拍照。

1.2.7RT-qPCR法檢測HIF-1α mRNA表達(dá) 將HemECs接種于培養(yǎng)皿，加入25 μmol/L姜黃素或DMSO(對(duì)照)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。按照Trizol試劑盒說明書操作，提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBER Green法實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測。引物由上海生工公司合成，HIF-1α F：5′-GTCAGGAGACAACCACG-3′，R：5′-TGAATGGCCTGTGCA-GTG-3′；VEGF F：5′-TGTAAGGACGAAACGGGACT-3′，R：5′-AAAGCCAGCAGCAATTTCT-3′；GAPDH F：5′-CCAGGGCTTTTAACTC-3′，R：5′-GCTCCCCCGC-AAATGA-3′。2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.8Western blot檢測MCL-1、cl-Caspase-3和cl-PARP蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，預(yù)冷 PBS 清洗，加入RIPA 裂解液提取總蛋白。 BCA 法測定總細(xì)胞提取液中蛋白濃度，取總蛋白25 μg上樣。經(jīng)SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)膜，置于 5% 脫脂奶粉中封閉2 h，加入一抗4℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗滌，加HRP 標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。

2 結(jié)果

2.1HemECs分離、鑒別 免疫熒光染色檢測顯示，細(xì)胞表面Ⅷ因子、CD31、CD34均顯強(qiáng)陽性，提示從IH組織中分離的細(xì)胞為HemECs，見圖1。

圖1 HemECs鑒別(×200)

2.2姜黃素對(duì)HemECs增殖的抑制作用 CCK-8結(jié)果顯示，48 h后不同濃度姜黃素均能抑制HemECs增殖，且姜黃素處理48 h后HemECs的IC50為31 μmol/L,臺(tái)盼藍(lán)法檢測結(jié)果顯示，姜黃素治療48 h后HemECs死亡呈劑量依賴性，見圖2。

圖2 姜黃素對(duì)HemECs增殖的抑制作用(×400)

2.3流式細(xì)胞儀檢測HemECs凋亡及電鏡觀察結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，對(duì)照組和姜黃素組HemECs凋亡率分別為(3.9±0.2)%、(33.6±3.6)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3；透射電鏡觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組IH內(nèi)皮細(xì)胞胞膜完整、胞漿均一，具有相對(duì)正常的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體結(jié)構(gòu)。姜黃素組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)特征，細(xì)胞膜形態(tài)基本完整，但核內(nèi)染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，發(fā)生碎裂，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)可見凋亡小體形成，見圖4。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測HemECs凋亡

圖4 電鏡觀察HemECs結(jié)構(gòu)變化(×700)

2.4姜黃素對(duì)HemECs中HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響 免疫熒光結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，48 h后姜黃素下調(diào)HIF-1α 和VEGF蛋白表達(dá)，見圖5；RT-qPCR結(jié)果顯示，姜黃素可明顯抑制HemECs中HIF-1α mRNA及VEGF mRNA表達(dá)(P<0.05)，見圖6。

2.5HemECs中MCL-1、cl-Caspase-3和cl-PARP蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果可知，姜黃素組MCL-1蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，而cl-Caspase-3 和cl-PARP蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見圖7。

圖7 Western blot檢測HemECs MCL-1、cl-Caspase-3和cl-PARP蛋白表達(dá)

3 討論

姜黃屬姜科植物，主要生長于熱帶和亞熱帶地區(qū)。姜黃素為姜黃的主要活性成分，具有消腫止痛、行氣活血、通經(jīng)止痛等作用。研究表明，姜黃素具有抗微生物、清除自由基、抗炎、抗氧化、抗癌、抗肝纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用[6]。姜黃素可通過不同途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且對(duì)正常細(xì)胞無影響。美國國立腫瘤研究所已將姜黃素作為抗突變劑和抗癌劑列為第3代抗癌化學(xué)藥，其抗腫瘤作用可通過多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)，如細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、血管生成、浸潤和轉(zhuǎn)移等[7]。

缺氧誘導(dǎo)因子 HIF-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是最重要的低氧轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在缺氧的肝癌細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)[8]。 HIF-1α 是HIF-1的亞基，是唯一的氧調(diào)節(jié)單位，決定HIF-1活性，可促進(jìn)腫瘤增殖、新生血管形成及維持腫瘤細(xì)胞的量代謝；VEGF是具有內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原，通過特異性受體VEGFR介導(dǎo)其生物學(xué)效應(yīng)，誘導(dǎo)血管及淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)多種腫瘤血管形成和腫瘤生長[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，48 h后不同濃度姜黃素均可抑制HemECs增殖，且呈劑量依賴性。免疫熒光結(jié)果顯示，48 h后姜黃素下調(diào)HIF-1α 和VEGF蛋白表達(dá)，RT-qPCR結(jié)果顯示，姜黃素能明顯抑制HemECs中HIF-1α mRNA表達(dá)，提示姜黃素可抑制HemECs中HIF-1α蛋白表達(dá)，從而下調(diào)VEGF蛋白表達(dá)，上調(diào)其抗增殖活性，與既往研究結(jié)論一致[10]。HIF-1α可在正常和腫瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié)MCL-1轉(zhuǎn)錄，表明抑制HIF-1α也可抑制MCL-1表達(dá)[11]。

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，對(duì)照組和姜黃素組HemECs凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，透射電鏡觀察結(jié)果顯示姜黃素處理后HemECs超微結(jié)構(gòu)具有凋亡形態(tài)學(xué)特征。同時(shí)，Western blot檢測姜黃素組HemECs中cl-Caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高，提示姜黃素可誘導(dǎo)HemECs凋亡。

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定生理或病理?xiàng)l件下出現(xiàn)的正常的選擇性死亡，由于其被細(xì)胞內(nèi)部某些特定基因所操縱，故稱程序性死亡。過度凋亡可能會(huì)引發(fā)神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)、心臟衰竭等,而抑制凋亡則與腫瘤等疾病發(fā)生有關(guān)。髓細(xì)胞白血病基因-1(myeloid cell leukemin-1，MCL-1)是Bcl-2家族基因中抗細(xì)胞凋亡成分，MCL-1基因在人多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且和腫瘤耐藥性關(guān)系密切。研究顯示，MCL-1作用于 Caspase-3 上游，其裂解產(chǎn)物可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2 家族蛋白激活可誘導(dǎo)線粒體膜透化，調(diào)節(jié)Cyt-C在線粒體中的釋放進(jìn)而激活Caspase-9前體，最終引起Caspase-3剪切活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12,13]。Caspase-3 在細(xì)胞凋亡中扮演死亡執(zhí)行者角色，參與多種重要細(xì)胞成分切割，如DNA依賴的蛋白激酶(DNA-PK)、聚ADP核糖聚合酶(PARP)等，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。PARP廣泛存在于真核細(xì)胞核內(nèi)，是細(xì)胞活力的穩(wěn)定器和DNA損傷的感受器，可識(shí)別結(jié)構(gòu)損傷DNA片段而被激活，進(jìn)而修復(fù)損傷的DNA。c-PARP是細(xì)胞凋亡的特征性標(biāo)志物，其無法識(shí)別損傷DNA，但具有DNA修復(fù)的聚合酶活性，聚集于細(xì)胞質(zhì)[15]。本研究Western blot檢測結(jié)果顯示，姜黃素組MCL-1蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，而cl-Caspase3 和cl-PARP蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，表明姜黃素可能通過下調(diào)HemECs中MCL-1表達(dá)，從而上調(diào)下游因子Caspase-3及cl-PARP表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究顯示姜黃素可在體外劑量依賴性抑制HemECs增殖、凋亡，其機(jī)制可能為抑制MCL-1和HIF-1α表達(dá)，從而上調(diào)cl-Caspase-3 和cl-PARP表達(dá)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。