周 琦 劉 敏 駱春艷 明 強(qiáng) (同濟(jì)天佑醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢 461000)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是一種蒽環(huán)類抗生素，臨床上用于多種癌癥的治療[1]。但治療過(guò)程中DOX會(huì)引發(fā)多種不良反應(yīng)，其中心臟毒性最為常見[1，2]。DOX引起的心臟損傷臨床表現(xiàn)為左心室收縮功能降低，最終導(dǎo)致心力衰竭[3]。其誘導(dǎo)的心臟毒性的確切機(jī)制尚未完全闡明。許多研究證實(shí)DOX誘導(dǎo)的心臟毒性與大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成和Caspase-3激活有關(guān)[4，5]。

MicroRNA(miRNA)是一種在進(jìn)化上高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA，長(zhǎng)度約20～25個(gè)核苷酸，與多種疾病密切相關(guān)，其中包括自身免疫性疾病以及腫瘤等。除此之外，miRNA在心臟疾病領(lǐng)域中的研究也日益深入[6，7]。miR-19b是miRNA家族成員之一，大量研究表明miR-19b參與心臟的早期發(fā)育過(guò)程，同時(shí)參與包括心肌梗死、病毒性心肌炎等在內(nèi)的多種心血管疾病的發(fā)展過(guò)程[8]，但其在DOX誘導(dǎo)的心臟毒性方面的研究較少。本研究通過(guò)調(diào)控miR-19b在DOX誘導(dǎo)后的H9c2心肌細(xì)胞中的表達(dá)，探討miR-19b對(duì)DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響，以期為減少DOX對(duì)心臟的毒副作用提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠心肌細(xì)胞系H9c2(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；miR-19b mimic/inhibitor序列(廣州瑞博生物技術(shù)有限公司)；Trizol總RNA提取試劑盒(Ambion公司)；Advantage RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程有限公司)；SYBR Green PCR試劑盒(KAPA Biosystems公司)；MTT、RIPA(強(qiáng))組織細(xì)胞快速裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、PBS緩沖液、兔抗Bad抗體、兔抗Bcl-2抗體、兔抗Caspase-3抗體、兔抗GAPDH抗體、羊抗兔IgG抗體、ROS檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；兔抗Caspase-9、兔抗細(xì)胞色素C(Cytochrome C，Cyt-C)抗體、兔抗p53抗體(Abcam公司)；ATP含量檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 大鼠心肌細(xì)胞H9c2于DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清+100 U/ml青霉素+ 100 U/ml鏈霉素)中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)用0.25%胰酶消化、傳代。

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞，分成6組：①空白對(duì)照組(Control組)：H9c2細(xì)胞正常培養(yǎng)；②DOX組：250 ng/ml DOX處理H9c2細(xì)胞[9]；③mimic NC組：H9c2細(xì)胞經(jīng)250 ng/ml DOX處理24 h后，轉(zhuǎn)染miR-19b mimic NC；④inhibitor NC組：H9c2細(xì)胞經(jīng)250 ng/ml DOX處理24 h后，轉(zhuǎn)染miR-19b inhibitor NC；⑤miR-19b mimic組：H9c2細(xì)胞經(jīng)250 ng/ml DOX處理24 h后，轉(zhuǎn)染miR-19b mimic；⑥miR-19b inhibitor組：H9c2細(xì)胞經(jīng)250 ng/ml DOX處理24 h后，轉(zhuǎn)染miR-19b inhibitor。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)250 ng/ml DOX處理12、24、48 h后H9c2細(xì)胞的活性，確定DOX的處理時(shí)間。將對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于96孔板中，180 μl/孔，細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/孔，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁。加入DOX分別培養(yǎng)12、24、48 h后取出孔板，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，37 ℃培養(yǎng)4 h。棄上清，加入150 μl二甲亞砜，振蕩10 min，在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞70%融合時(shí)，采用DOX處理細(xì)胞 24 h，隨后根據(jù)LipofiterTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書，分別轉(zhuǎn)染miR-19b mimic和miR-19b inhibitor以及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)6 h后換新鮮培養(yǎng)基。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)miR-19b的表達(dá) 轉(zhuǎn)染24 h后，采用Trizol法提取各組細(xì)胞中總RNA，隨后將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，分別擴(kuò)增U6和miR-19b。U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′；miR-19b上游引物：5′-GGGTGTGCAAATCCATGC-3′，下游引物：5′-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95℃變性5 s，56℃退火10 s，72℃延伸25 s，共39個(gè)循環(huán)；65℃延伸5 s。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS水平 轉(zhuǎn)染24 h后根據(jù)ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。DCFH-DA稀釋至10 μmol/L，將處理后的各組細(xì)胞懸浮于其中，細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml，37℃孵育20 min，每隔4 min 顛倒混勻1次。收集各組細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS水平。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位 轉(zhuǎn)染24 h后取10萬(wàn)～60萬(wàn)細(xì)胞重懸于0.5 ml細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入0.5 ml JC-1染色液，混勻后37 ℃ 孵育20 min。600 μg，4 ℃離心4 min，棄上清。1 ml JC-1染色液重懸細(xì)胞，600 μg，4 ℃離心4 min，棄上清(重復(fù)2次)。用JC-1染色液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位。

1.2.7ATP水平檢測(cè) 轉(zhuǎn)染24 h后根據(jù)ATP含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，在636 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度。

1.2.8Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染24 h后，收集各組細(xì)胞提取總蛋白，蛋白采用BCA試劑盒定量后經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，再將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入一抗稀釋液(Bad，Bcl-2，Caspase-9，Caspase-3，Cyt-C，p53，GAPDH)，室溫孵育1 h。PBS洗滌3次，每次5 min，加入二抗稀釋液(HRP標(biāo)記的IgG)，室溫孵育1 h。PBS洗滌3次，每次5 min，加入化學(xué)發(fā)光試劑，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)。GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1DOX 抑制H9c2心肌細(xì)胞增殖 與對(duì)照組相比，H9c2心肌細(xì)胞的活性隨著DOX作用時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸降低(圖1)；當(dāng)DOX處理細(xì)胞12 h后，細(xì)胞存活率無(wú)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；處理24 h后，細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；處理48 h后細(xì)胞存活差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但毒副作用較大；因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)DOX的處理時(shí)間選用24 h。

圖1 DOX降低H9c2心肌細(xì)胞活性

2.2miR-19b mimic/inhibitor明顯改變H9c2心肌細(xì)胞中miR-19b的表達(dá)量 與對(duì)照組相比，DOX組細(xì)胞中miR-19b的表達(dá)量降低(P<0.05)。與DOX組相比，mimic NC組和inhibitor NC組miR-19b的表達(dá)量無(wú)明顯變化；miR-19b inhibitor 組miR-19b的表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，而miR-19b mimic 組miR-19b的表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染后H9c2心肌細(xì)胞中miR-19b的表達(dá)情況

2.3miR-19b過(guò)表達(dá)抑制DOX誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生 與DOX組比較，mimic NC組和inhibitor NC組細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生無(wú)明顯變化；miR-19b inhibitor組細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生增多；miR-19b mimic 組細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生減少，見圖3。

圖3 DOX對(duì)H9c2心肌細(xì)胞中ROS表達(dá)的影響

2.4miR-19b過(guò)表達(dá)抑制DOX誘導(dǎo)后H9c2心肌細(xì)胞線粒體膜電位的降低 與DOX組比較，mimic NC組和inhibitor NC組中處于正常線粒體膜電位的細(xì)胞比例無(wú)明顯變化；miR-19b inhibitor組中線粒體低電位細(xì)胞比例增多；miR-19b mimic組中線粒體低電位細(xì)胞比例減少，見圖4。

圖4 DOX對(duì)H9c2心肌細(xì)胞線粒體膜電位情況的影響

2.5miR-19b過(guò)表達(dá)提高DOX誘導(dǎo)后H9c2心肌細(xì)胞中ATP含量 與DOX組比較，mimic NC組和inhibitor NC組細(xì)胞中ATP的含量無(wú)明顯變化；miR-19b inhibitor組細(xì)胞中ATP的含量降低(P<0.05)；miR-19b mimic組細(xì)胞中ATP的含量升高(P<0.05)，見圖5。

圖5 DOX對(duì)H9c2心肌細(xì)胞中ATP含量的影響

2.6miR-19b過(guò)表達(dá)抑制H9c2心肌細(xì)胞凋亡 與DOX組比較mimic NC組和inhibitor NC組細(xì)胞中Bad、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、Cyt-C和p53蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯變化；miR-19b inhibitor組細(xì)胞中Bad、Caspase-9、Caspase-3、Cyt-C和p53蛋白的表達(dá)水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；miR-19b mimic組細(xì)胞中Bad、Caspase-9、Caspase-3、Cyt-C和p53蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，見圖6。

圖6 DOX對(duì)H9c2心肌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)的情況影響

3 討論

DOX可以顯著提高癌癥患者的生存率，但是DOX引發(fā)的心臟毒性，并伴隨左心室功能障礙和心力衰竭，嚴(yán)重影響了癌癥患者的生活質(zhì)量[10]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，ROS的過(guò)量產(chǎn)生參與DOX誘導(dǎo)的心臟毒性過(guò)程，過(guò)量產(chǎn)生的ROS引起氧化損傷和心肌細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致心力衰竭[11]。心肌細(xì)胞凋亡在DOX誘導(dǎo)的慢性心肌毒性過(guò)程中起重要作用[12，13]。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明，DOX誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，這可能與ROS導(dǎo)致DNA損傷、線粒體功能障礙、蛋白質(zhì)合成抑制及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能破壞有關(guān)[5，14，15]。

線粒體是產(chǎn)生ROS的主要細(xì)胞器，也是ROS誘導(dǎo)氧化損傷的重要靶點(diǎn)，并在能量生產(chǎn)、細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡誘導(dǎo)等多種生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[16-18]。ROS誘導(dǎo)線粒體損傷主要是通過(guò)調(diào)控線粒體蛋白、線粒體脂質(zhì)體和線粒體DNA的改變實(shí)現(xiàn)的[19]。p53是重要的抑癌基因，同時(shí)參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。當(dāng)ROS誘導(dǎo)DNA發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷且無(wú)法修復(fù)時(shí)，p53可以通過(guò)增加Bax蛋白的表達(dá)或促使Bcl-2蛋白失活對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)[20]。Bax和Bcl-2均屬于Bcl-2家族蛋白，該家族蛋白是一類可以通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜通透性從而調(diào)控細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)。Bax的激活表達(dá)和Bcl-2的抑制可促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的打開，從而導(dǎo)致Cyt-C從線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而激活Caspase-9及其下游因子Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。Bad是Bcl-2家族的另外一種蛋白，在促進(jìn)線粒體相關(guān)凋亡中同樣起重要作用[21]。ATP是生物體最直接的能量來(lái)源，主要由線粒體產(chǎn)生。上調(diào)ATP水平，可以抑制心肌細(xì)胞線粒體中Cyt-C的釋放，緩解ROS誘導(dǎo)的線粒體損傷[22]。

研究表明，miR-19b在心肌炎患者血漿中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-19b可以明顯提高心肌細(xì)胞的存活率，抑制心肌細(xì)胞凋亡[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，DOX可下調(diào)H9c2心肌細(xì)胞中miR-19b的表達(dá)，上調(diào)DOX誘導(dǎo)后的H9c2心肌細(xì)胞中miR-19b的表達(dá)，可以抑制心肌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，降低細(xì)胞線粒體膜電位下降的細(xì)胞比例，同時(shí)抑制Bad、Caspase-9、Caspase-3、Cyt-C和p53蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá)；而miR-19b抑制與miR-19b過(guò)表達(dá)的作用相反。

綜上所述，miR-19b過(guò)表達(dá)能緩解DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與抑制ROS產(chǎn)生及線粒體相關(guān)凋亡有關(guān)，這為減少DOX對(duì)心臟的毒副作用方面研究提供研究思路。