劉遠靈 曾昭昌 張建軍 (廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科,廣州 510000)

膀胱癌(bladder cancer，BC)作為臨床最常見的尿路系統(tǒng)腫瘤之一，具有發(fā)病迅速，轉移率高的特點，男性發(fā)病率高于女性[1]。BC早期癥狀不明顯，患者在就診時往往已經(jīng)處于晚期，目前治療BC的主要手段是手術及術后化療藥物灌注，但仍有50%以上的患者復發(fā)[2]。研究表明，上皮間質轉化( epithelial-mesenchymaltransition，EMT)是癌癥轉移的主要因素，也是治療失敗的重要原因，因此尋找新的治療靶點尤為迫切[3]。長鏈非編碼RNA(long-chain noncoding RNA，lncRNA)是一類不編碼蛋白的RNA分子，長度介于200～100 000 nt之間[4]。研究表明，lncRNA在腫瘤細胞周期、腫瘤細胞侵襲轉移與化療耐藥等相關信號通路中均發(fā)揮調節(jié)作用，其作用類似于癌基因或抑癌基因[5]。作為lncRNA 家族成員之一，lncRNA NEAT1已被證實在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮分化調控的作用，且在多種腫瘤中異常表達[6]。BC的發(fā)生發(fā)展及EMT過程中有諸多非編碼RNA、抑癌基因、促癌基因及蛋白因子的參與，但目前鮮有關于lncRNA NEAT1在BC中的作用研究。因此，本研究通過對BC組織和細胞株的研究，探討lncRNA NEAT1對BC細胞增殖、侵襲、遷移及EMT的影響及其可能的作用機制，為臨床治療BC提供新思路。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1組織標本 收集2015年3月～2018年5月于我院接受手術治療的143例BC患者癌組織及距離癌組織超過2cm處的正常組織，用以上組織構建BC組織芯片。在經(jīng)免疫組織化學染色后有15例組織標本出現(xiàn)不同程度的缺失，其余128例標本經(jīng)組織病理學檢測證實為原發(fā)性BC，并納入研究。其中男性患者85例，女性患者43例，年齡38～78歲，平均年齡(55.28±6.76)歲，組織學分型：高分化患者25例，中分化患者56例，低分化患者47例，術前患者均未進行放化療。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準，所有患者均同意并簽署知情同意書。

1.1.2細胞來源 人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1、人源BC細胞株T24、5637、SCaBER、J82、UM-UC-3均購自上海博古生物技術有限公司。

1.1.3儀器與試劑 siNEAT1及陰性對照物NC、lncRNA NEAT1及U6引物均由上海吉瑪制藥技術有限公司設計完成。DMEM培養(yǎng)基(D777)、SYBR Green 熒光定量PCR 檢測試劑盒(QPK-201)購自TOYOBO；TRIzol reagent(9009)購自TaKaRa；免疫熒光試劑盒、Transwell小室采購自BD；E-cadherin、Vimentin、TGF-β2、Smad2一抗、二抗均購自北洋百川生物技術有限公司；MTT試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Alexa Fluor594-偶聯(lián)二抗購自美國Invitrogen公司。蘇凈Airtech超凈工作臺；三洋 MCO-15AC細胞培養(yǎng)箱；尼康 Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡；艾本德5810R 型高速離心機；羅氏 R480實時熒光定量PCR儀；蔡司LSM710共聚焦激光掃描顯微鏡。

1.2方法

1.2.1細胞轉染 調整BC T24細胞株濃度至1×106個/ml，取2 ml接種于6孔板，培養(yǎng)過夜，采用Lipofectamine 2000將濃度為100 nmol/L的siNEAT1和NC轉染至細胞，以不轉染的T24細胞為空白對照，得到T24-siNEAT1及T24-NC細胞株。

1.2.2qRT-PCR檢測lncRNA NEAT1表達 TRIzol法提取各組細胞總RNA，并按照PrimeScrip反轉錄試劑盒說明書反轉錄成cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq說明書配置PCR反應體系，反應條件為：95℃預變性10 min，95℃ 10s，60℃ 30 s，72℃ 10s，40 個循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 30s。PCR引物序列：U6(F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′)，lncRNA NEAT1(F：5′-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3′，R：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′)，miR-200a-3p(F：5′-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3′，R：5′-GTGCAGGG-TCCGAGGT-3′)，相對表達量采用2-ΔΔCt表示。每個樣本獨立重復實驗3 次。

1.2.3MTT及平板克隆實驗檢測細胞增殖 將T24、T24-NC及T24-siNEAT1細胞按照500～1 000個/孔鋪至96 孔板，輕輕混勻后，置入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每孔加20 μl MTT溶液，37℃避光4 h 后，棄掉孔內液體，各加入100 μl DMSO，37℃搖床快速振蕩15 min充分溶解結晶物，酶標儀檢測492 nm 處的OD值。將上述兩種穩(wěn)轉細胞以5 000個/孔鋪6孔板繼續(xù)培養(yǎng)，隔周更換新鮮培養(yǎng)液，2周后用考馬斯亮藍染色，記錄菌落形成數(shù)量。

1.2.4Transwell實驗檢測細胞侵襲 實驗前12 h更換為無血清培養(yǎng)基，將40 μl matrigel基質膠鋪于Transwell小室消化細胞，并用1×PBS清洗2遍，將500 μl 完全培養(yǎng)基加入24 孔板，細胞計數(shù)，取5×105個細胞重懸，向Transwell小室中加200～250 μl 細胞懸液，保證下層完全培養(yǎng)基與Transwell小室間無氣泡，置于培養(yǎng)箱內正常培養(yǎng) 24 h，加用甲醇配制、PBS 稀釋的0.1 %結晶紫染液500 μl染色，室溫避光15 min，PBS 漂洗后用棉棒擦Transwell小室內部，倒置晾干，倒置熒光顯微鏡觀察穿過膜的細胞并拍照計數(shù)。

1.2.5免疫熒光檢測E-cadherin和Vimentin表達 細胞接種于玻片上，培養(yǎng)固定，4℃孵育過夜，用E-cadherin或Vimentin抗體進行免疫熒光分析(1∶1 000)。乙醇梯度洗脫后，室溫下用Alexa Fluor 594-偶聯(lián)二抗(1∶5 000)孵育1 h，DAPI染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6生物信息學預測 利用生物信息學網(wǎng)站starBase預測可與NEAT1互補結合的miRNA，根據(jù)Targetscan網(wǎng)站預測相應miRNA可靶向結合的基因。

1.2.7Western blot檢測蛋白表達 向培養(yǎng)48 h后的細胞中加入適量RIPA裂解液裂解30 min，12 000 r/min 4℃離心10 min，收集上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白樣品和Loading buffer混合，100℃水浴變性5 min，加入至制備好的SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)，25 μl/孔上樣，調整濃縮膠電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結束后取出凝膠，4℃轉膜1.5 h，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入相應一抗，4℃過夜，TBST沖洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，37℃孵育2 h后加入ECL顯影，采用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析蛋白水平。

2 結果

2.1lncRNA NEAT1在BC組織、癌旁組織中的表達 qRT-PCR結果顯示，BC組織中NEAT1表達水平高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NEAT1在腫瘤細胞中的表達明顯高于人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且在T24細胞中表達量最高(P<0.01)，適合使用RNA干擾的方法進行后續(xù)NEAT1基因功能的研究，見圖1。

圖1 lncRNA NEAT1在BC組織和不同BC細胞系中的表達

2.2細胞系構建 qRT-PCR結果顯示，空白對照組與T24-NC組NEAT1表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，T24-siNEAT1組細胞中NEAT1表達量明顯低于空白對照組和T24-NC組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示成功構建NEAT1沉默細胞系，見圖2。

圖2 lncRNA NEAT1在各組T24細胞中的表達

2.3NEAT1對BC細胞株T24增殖能力的影響 轉染2周后T24-siNEAT1組細胞中NETA1表達與空白對照組和T24-NC組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；MTT實驗結果顯示，與空白對照組和T24-NC組相比，NEAT1被沉默后，T24-siNEAT1組OD492值明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。平板克隆實驗結果顯示，沉默NEAT1后，T24-siNEAT1細胞克隆數(shù)顯著減少(P<0.05)。提示NEAT1被沉默后，細胞增殖能力顯著降低，見圖3。

圖3 lncRNA NEAT1對各組T24細胞增殖能力的影響

2.4lncRNA NEAT1對BC細胞株T24侵襲能力的影響 Transwell實驗顯示，與空白對照組和T24-NC組相比，沉默NEAT1后，T24-siNEAT1細胞通過matrigel基質膠的數(shù)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該結果表明沉默NEAT1后，細胞侵襲能力明顯降低(圖4)。

圖4 lncRNA NEAT1對各組T24細胞侵襲能力的影響

2.5lncRNA NEAT1對EMT相關分子表達的影響 Western blot結果顯示， 與空白對照組和T24-NC組相比，T24-siNEAT1組細胞E-cadherin表達明顯升高，Vimentin表達明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；E-cadherin和Vimentin在免疫熒光中呈現(xiàn)紅色，結果顯示，T24-siNEAT1組細胞中E-cadh-erin明顯增多，Vimentin明顯降低。提示沉默NEAT1影響細胞EMT，見圖5。

圖5 lncRNA NEAT1對E-cadherin和Vimentin表達的影響

2.6生物信息學預測 starBase網(wǎng)站預測結果顯示，NEAT1可與miR-200a-3p互補結合(圖6A)，Targetscan 網(wǎng)站預測分析顯示，miR-200a-3p與TGF-β2存在靶向結合位點(圖6B)。

圖6 生物信息學預測lncRNA NEAT1與TGF-β2的關系

2.7lncRNA NEAT1與TGF-β2/Smad2的作用關系 qRT-PCR和Western blot結果顯示T24-siNE-AT1組中miR-200a-3、TGF-β2及p-Smad2表達明顯低于空白對照組與T24-NC組(P<0.05)，空白對照組和T24-NC組中上述指標的表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示NEAT1對TGF-β2/Smad2通路蛋白表達具有促進作用，見圖7。

圖7 lncRNA NEAT1與TGF-β2/Smad2的作用關系

3 討論

膀胱尿路上皮細胞癌因發(fā)病位置比較隱蔽，不易檢查，且早期癥狀復雜，缺少明顯特征，常導致診斷和治療延誤[7]。因此從分子生物學角度出發(fā)尋找其進展和轉移的標志物，對于患者選擇合適的治療方法及預后指標的判定具有重要意義。

有研究表明，一些lncRNA在腫瘤中異常表達，功能類似于癌基因或抑癌基因，其可通過參與調控細胞周期影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。尚無標志性lncRNA可以直接預測BC。目前已經(jīng)證實lncRNA NEAT1在多種癌癥中特異性表達[9]。Qi等[10]采用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)NEAT1在肺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織。Zheng等[11]研究表明在胰腺癌患者癌組織和血清中，NEAT1表達量上調。NEAT1在胰腺癌細胞分化過程中表達量顯著升高，而被沉默后，胰腺癌細胞的增殖能力明顯減弱，且與增殖相關的基因表達亦降低，推測lncRNA NEAT1可促進胰腺癌細胞增殖[12]。本研究采用qRT-PCR檢測lncRNA NEAT1在BC組織、癌旁組織及不同細胞系中的表達，發(fā)現(xiàn)在BC組織和癌細胞中其表達水平明顯高于癌旁組織及正常細胞，提示NEAT1可能在BC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。為了進一步研究lncRNA NEAT1在BC中的作用，本研究在構建了NEAT1沉默細胞系的基礎上研究發(fā)現(xiàn)，NEAT1下調后，BC細胞T24的侵襲能力和遷移能力明顯降低。

EMT是指上皮細胞轉化為間質細胞的生物學行為，在胚胎形成、器官發(fā)育、組織再生和腫瘤轉移過程中起重要作用。在腫瘤進展中，分別代表上皮細胞和間質細胞的標記物E-cadherin和Vimentin的異常表達可以反映出腫瘤細胞的侵襲能力、藥物敏感性及抗凋亡能力的變化[13]。 NEAT1在乳腺癌中表達明顯高于癌旁組織，對腫瘤的遷移和EMT起到促進作用[14]。本研究顯示，與對照組相比，T24-siNEAT1細胞中E-cadherin表達明顯升高，Vimentin表達明顯降低。提示NEAT1可能通過促進BC T24細胞的EMT過程提高細胞的遷移能力。

研究表明，miRNA是通過堿基不完全互補的方式結合于靶基因，從而影響腫瘤細胞的凋亡、遷徙與轉移，并引發(fā)周圍細胞的壞死與凋亡[15]。同時，miRNA也是lncRNA發(fā)揮作用的重要環(huán)節(jié)。本研究應用starBase數(shù)據(jù)庫，預測NEAT1可與miR-200a-3p互補結合。Sharp等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-200a-3p在食管癌組織中表達高于癌旁組織，上調其表達可促進食管癌細胞的增殖、遷移及EMT，miR-200a-3p作為癌基因對食管癌的進展發(fā)揮促進作用。本研究中，T24細胞NEAT1沉默后，miR-200a-3p下降。提示NEAT1對BC細胞株T24的增殖及EMT的促進作用可能與miR-200a-3p上調有關。Targetscan 網(wǎng)站預測顯示，miR-200a-3p可互補結合TGF-β2，進一步分析顯示，miR-200a-3p表達下調后，TGF-β2蛋白表達降低。TGF-β2/smad2 信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，該通路通過磷酸化轉錄因子Smad 蛋白實現(xiàn)細胞內通路信號的傳導[17]。Smad 蛋白包括 Smad1-Smad9，其中當 Smad2磷酸化水平升高時，TGF-β2/Smad2信號通路的生物學功能發(fā)生轉變，對腫瘤細胞增殖和侵襲起促進作用[18]。這可能是由于Smad2蛋白通過與E-cadherin啟動子區(qū)域的E-box結合，抑制E-cadherin的表達，進而促進EMT和細胞侵襲[19]。本研究發(fā)現(xiàn)T24-siNEAT1組細胞中Smad2磷酸化水平明顯降低。 既往研究發(fā)現(xiàn)，下調NEAT1表達后，TGF-β2蛋白表達降低，從而抑制結直腸癌的侵襲與遷移[20]。提示NEAT1可能通過調節(jié) TGF-β2/smad2 信號通路抑制細胞EMT過程，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，lncRNA NEAT1在膀胱癌組織及細胞中高表達，高表達的NEAT1可能通過上調miR-200a-3p，調控TGF-β2/Smad2信號通路，促進EMT過程，從而影響B(tài)C的發(fā)展。