羅玉嬌 鄭小莉 羅 波 曾靜媛 左 英

(西南醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，瀘州 646000)

膿毒血癥屬于多因素誘發(fā)的全身炎癥反應綜合征，病情進展迅速，可導致休克或多器官功能衰竭，病死率高達50%以上[1]。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒血癥誘導機體免疫抑制所致的炎癥因子過量產生是其發(fā)生的重要病理生理過程[2]。多形核性粒細胞(polymorpho-nuclear neutrophil,PMN)是天然免疫系統(tǒng)的關鍵細胞，在機體感染病原體時，PMN可從血管處遷移出并迅速趨化募集至感染部位并吞噬和殺傷病原體，在完成吞噬、滅菌作用后即發(fā)生凋亡，若凋亡延遲，可導致組織細胞損傷[3]。研究表明，膿毒血癥患者體內PMN凋亡受到抑制，且遷移、殺菌等功能降低，可能在膿毒血癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。程序性死亡配體 1(programmed death ligand 1，PD-L1)是免疫應答的協(xié)同抑制分子之一，對免疫功能起負性調控作用[5]。研究顯示敲除 PD-L1基因的膿毒血癥小鼠生存率及細菌清除率均顯著高于未敲除PD-L1的小鼠[6]。故推測PD-L1可能是膿毒血癥免疫治療的潛在靶點。本研究通過分析膿毒血癥患者外周血PMN凋亡及PD-L1表達、構建 PD-L1 質粒并建立大鼠膿毒血癥模型，以研究體內沉默PD-L1基因對膿毒血癥大鼠外周血PMN表達的影響。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1病例選擇及分組 選擇2017年1月～2018年12月于本院住院治療的12例膿毒血癥患者作為膿毒血癥組，其中肺部感染7例，急性腹腔感染2例，頜面部感染2例，感染部位不明但血培養(yǎng)陽性者1例。均為年齡為21～75歲的非妊娠患者。所有患者均符合1991年美國胸科醫(yī)師學會(ACCP)/危重病醫(yī)師協(xié)會(SCCM)聯(lián)席會議有關膿毒血癥的診斷標準。同時選取本院同期行健康體檢的15名健康志愿者對照組。兩組年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經本院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者或家屬知情同意。

1.1.2實驗動物 SPF級成年雄性SD大鼠60只，7周齡，體質量250～300 g，購自西南醫(yī)科大學動物實驗中心，動物合格證號：SCXK(川)2018-17。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在22～25℃，相對濕度40%～70%，晝夜節(jié)律每12 h交替，自由飲水和進食，所有大鼠均適應性喂養(yǎng)1周后進入本實驗。

1.1.3試劑 轉染試劑Lipofectamine 2000、opti-PD-L1 單克隆抗體(Ebioscience公司)；PVDF 膜(美國Millipore公司)；細胞凋亡檢測試劑盒(廣州杰特偉生物科技有限公司)；293T細胞(廣州沛瑜生物制品有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(賽默飛世爾科技有限公司，中國)；AXIS-SHIELD polymorphprep分離液(北京先明樂科技發(fā)展有限公司)； FBS(上海彩佑實業(yè)有限公司)；肝素(上海滬震實業(yè)有限公司)；Histopaque 1119、Histopaque 1083(上海北諾生物科技有限公司)；Annexin V-FITC、PI(上海翊圣生物科技有限公司)；TRIzol(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司)；Cleaved caspase-3、PKC-α及NF-κB抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)；羊抗兔抗體(賽默飛世爾科技有限公司，中國)。

1.2方法

1.2.1外周血PMN的制備及檢測 分別于確診6、12 h內抽取患者外周空腹靜脈血5 ml，肝素抗凝后，加入AXIS-SHIELD polymorphprep分離液，采用密度梯度離心法分離患者外周血PMN，采用10%FBS重懸細胞后，置于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，流式細胞術檢測PMN凋亡率，Western blot檢測PMN中PD-L1表達。

1.2.2慢病毒質粒的制備 將PD-L1 siRNA序列克隆到紅色熒光蛋白標記的載體中，取5 μg剛合成的載體和1 μl慢病毒包裝質粒，轉染至293T細胞，進行腺病毒重組、包裝和擴增，生成慢病毒質粒。轉染48 h后，采用0.45 μm醋酸纖維素過濾器過濾含有慢病毒質粒的上清液，離心，棄上清，-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3分組及模型建立 按照隨機數字表法將60只實驗大鼠隨機分成假手術組、模型組及實驗組，每組20只。假手術組僅開腹翻動盲腸，不予以結扎穿孔。模型組采用經典的盲腸結扎穿孔術制備膿毒血癥大鼠模型，造模前大鼠禁食12 h，自由飲水，10%水合氯醛腹腔麻醉后，切開大鼠腹中線，長約2 cm，分離并找到盲腸后進行結扎，采用9號針穿刺盲端腸壁2次，留置貫穿盲腸的橡皮片后，擠出少量糞便，還納盲腸，縫合腹壁，待大鼠清醒后，繼續(xù)進入代謝籠自由進食飲水。實驗組按照模型組的方法制備膿毒血癥大鼠模型，在造模前7 d腹腔注射PD-L1 500 μg，注射容積為80 ml/kg，假手術組及模型組注射等量生理鹽水。

1.2.4外周血 PMN的提取 各組分別于術后3、6、12 h抽取大鼠下腔靜脈血2.5 ml，肝素抗凝，加入Histopaque 1119和Histopaque 1083后，700 g離心 30 min，抽取PMN 富集層，PBS清洗2次，去除溶解的紅細胞，PBS清洗1次，采用瑞氏-姬姆薩染色，PMN純度達到95%以上方可用于后續(xù)實驗。

1.2.5流式細胞術檢測PMN的凋亡情況 各組分別于術后6、12 h抽取大鼠下腔靜脈血450 μl，分別加入5 μl液體Annexin V-FITC和50 μl PI，室溫避光孵育15 min，流式細胞術檢測PMN凋亡率。

1.2.6Western blot檢測PMN中Cleaved caspase-3、PKC-α及NF-κB水平 TRIzol法提取細胞總蛋白，經電泳分離蛋白、轉膜、封閉后，加入濃度為1∶500的一抗，4℃過夜；加入1∶1 000的二抗，室溫孵育2 h。ECL發(fā)光法顯色，以β-actin為內參，Odyssey掃描系統(tǒng)檢測蛋白條帶灰度值，采用目的條帶灰度值/β-actin灰度值計算目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1外周血PMN的凋亡率 膿毒血癥組患者在6、12 h時PMN的凋亡率分別為(27.45±2.47)%和(11.45±1.67)%；健康對照組在6、12 h時PMN的凋亡率分別為(63.22±2.88)%和(62.69±2.59)%。與健康志愿者相比，膿毒血癥患者在6、12 h時PMN凋亡水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 外周血PMN的凋亡率

2.2外周血PMN中PD-L1表達 膿毒血癥患者在6、12 h時PD-L1表達水平分別為1.05±0.14和1.28±0.16；健康對照組在6、12 h時PMN的PD-L1表達水平分別為0.42±0.08和0.53±0.11。與健康對照組相比，膿毒血癥患者在6、12 h時PD-L1的表達水平顯著提高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 外周血PMN中PD-L1表達

2.3膿毒血癥組粒細胞凋亡率和PD-L1表達的相關性 PMN 6、12 h的凋亡率分別與對應時段的PD-L1表達水平呈顯著負相關(r=-0.693，P=0.012；r=-0.685，P=0.014)。見圖3。

圖3 膿毒血癥組粒細胞凋亡率和PD-L1表達的相關性

2.4沉默PD-L1基因表達對膿毒血癥大鼠外周血PMN凋亡率的影響 流式細胞術檢測結果顯示，模型組6、12 h外周血PMN凋亡率為6.09%及5.91%，顯著低于假手術組同時段的22.97%及24.61%(P<0.05)；實驗組6、12 h外周血PMN凋亡率為17.22%及18.65%，顯著高于模型組同時段的凋亡率(P<0.05)，見圖4A、B。同時，模型組各時間點PMN中凋亡相關蛋白Cleaved caspase-3表達量亦顯著低于假手術組同時段(P<0.05)；實驗組各時間點Cleaved caspase-3表達量顯著高于模型組(P<0.05)，見圖4C、D。

圖4 沉默PD-L1基因表達對膿毒血癥大鼠外周血PMN凋亡率影響

2.5沉默PD-L1基因表達對膿毒血癥大鼠外周血PMN中PKC-α/NF-κB 信號通路相關蛋白表達的影響 模型組外周血PMN中PKC-α及NF-κB的磷酸化水平明顯增高，顯著高于假手術組(P<0.05)；實驗組外周血PMN中PKC-α及NF-κB的磷酸化水平明顯降低，顯著低于模型組(P<0.05)，見圖5。

圖5 沉默PD-L1基因表達對膿毒血癥大鼠外周血PMN中PKC-α/NF-κB信號通路相關蛋白的影響

3 討論

研究表明，膿毒血癥患者發(fā)病早期，內毒素可刺激單核-巨噬細胞活化，導致免疫炎癥瀑布樣連鎖反應，機體內可出現(xiàn)大量未成熟PMN，PMN功能障礙、凋亡延遲，其遷移、細菌清除及吞噬功能均發(fā)生異常，導致機體出現(xiàn)持續(xù)的免疫紊亂及嚴重感染[7，8]。本研究顯示，與健康志愿者相比，膿毒血癥患者在6、12 h時PMN凋亡水平顯著降低，提示膿毒血癥患者體內PMN的凋亡發(fā)生延遲，可能促進機體炎癥反應進展，加重膿毒血癥患者的病情，因此，改善患者體內PMN的凋亡延遲，可能有利于改善膿毒血癥患者的預后，提高治愈率。推測膿毒血癥患者體內可能存在一些抑制PMN凋亡的物質。

最新研究發(fā)現(xiàn)，PMN表面的協(xié)同抑制分子PD-L1在人體發(fā)生嚴重感染時呈高表達，PMN的活性受到明顯抑制[9，10]。提示PD-L1可能成為膿毒血癥患者的潛在治療靶點，但其與膿毒血癥患者PMN凋亡之間的關系研究報道較少。本研究結果顯示，與健康志愿者相比，膿毒血癥患者在6、12 h時PD-L1表達水平顯著提高，且PMN 6、12 h的凋亡率與6、12 h PD-L1表達水平呈顯著負相關，提示PD-L1可能是介導膿毒血癥患者外周血PMN凋亡延遲的重要因子。

動物研究顯示，相較于野生型小鼠，基因敲除PD-L1的膿毒血癥小鼠生存時間顯著延長，炎癥因子表達水平顯著降低，進一步提示PD-L1在膿毒血癥的病程進展中發(fā)揮重要作用?；诖耍狙芯坑^察了沉默PD-L1基因對膿毒血癥大鼠外周血PMN凋亡的影響，結果顯示，模型組6、12 h血清PMN凋亡率顯著低于假手術組同時段水平，且模型組各時間點PMN中凋亡相關蛋白Cleaved caspase-3表達量亦顯著低于假手術組同時段水平，提示膿毒血癥大鼠體內PMN凋亡發(fā)生延遲。而實驗組6、12 h PMN凋亡率顯著高于模型組同時段凋亡率，且實驗組各時間點Cleaved caspase-3表達量顯著高于模型組同時段水平。提示沉默PD-L1基因能夠改善膿毒血癥大鼠PMN凋亡延遲的狀態(tài)，促進細胞凋亡，與本研究在膿毒血癥患者體內的檢測結果一致。

研究發(fā)現(xiàn)，PKC介導的NF-κB信號通路在炎癥性疾病的發(fā)病中發(fā)揮關鍵作用[11，12]。當PKC-α被激活后，可降解IκBα的磷酸化，從而促進NF-κB與抑制性蛋白IκB形成復合物，使NF-κB磷酸化而進入細胞核，促進TNF-α及IL-1β等炎癥因子釋放，促進機體炎癥反應的發(fā)生發(fā)展。本研究結果顯示，模型組外周血PMN中PKC-α及NF-κB的磷酸化水平明顯增高，顯著高于假手術組，提示膿毒血癥大鼠PMN中PKC-α/NF-κB信號通路被激活，促進炎癥因子的釋放。但實驗組外周血PMN中PKC-α及NF-κB的磷酸化水平明顯降低，顯著低于模型組，提示沉默PD-L1基因可抑制膿毒血癥大鼠PMN中PKC-α/NF-κB信號通路的激活。

綜上所述，膿毒血癥患者體內PMN凋亡發(fā)生延遲，而PD-L1在膿毒血癥患者中呈高表達，二者表達呈顯著負相關，提示PD-L1可能是調控膿毒血癥患者PMN延遲凋亡的重要分子。同時，通過大鼠實驗可以得出沉默PD-L1基因能夠改善膿毒血癥大鼠PMN凋亡延遲的狀態(tài)，其機制可能與抑制膿毒血癥大鼠PMN中的PKC-α-NF-κB信號通路的激活有關。由于研究時間較短，樣本量過少，故未進行人體內相關信號通路的檢測，使研究結論存在一定的缺陷。在下一步的研究中將和其他研究機構合作進行多中心研究，擴大病例數，深入研究影響患者PMN凋亡延遲的具體信號通路。