丁良怡，種剛剛，潘江，許建和

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237）

引 言

脂肪酸是一類由碳、氫、氧組成的，具有較長烴鏈的羧酸類化合物。脂肪酸是自然界最為豐富的物質(zhì)之一，而富含脂肪酸的油脂成為化工行業(yè)最重要的可再生原料[1]。人類對不可再生化石資源的過度依賴，促進(jìn)了全球生物柴油產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，植物油的綜合利用問題也日益突出[2]。植物油廣泛存在于自然界中，生產(chǎn)量巨大，然而目前大部分仍被簡單用于生產(chǎn)食用油和飼料添加劑，只有一小部分用于制造生物柴油和生物基化學(xué)品[3]。大多數(shù)植物油由1 mol 甘油和3 mol 脂肪酸組成，后者主要包括不飽和脂肪酸油酸和亞油酸，其中含有兩類活潑的官能團(tuán)，即末端羧基以及若干碳碳雙鍵，對這些基團(tuán)的各種修飾反應(yīng)是其工業(yè)用途的基礎(chǔ)。工業(yè)上，目前主要對脂肪酸的羧基進(jìn)行反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為脂肪醇類、酯類、酰胺類或胺類等，進(jìn)一步用于生產(chǎn)表面活性劑、增塑劑、涂料等產(chǎn)品[4]。隨著生物化工技術(shù)的發(fā)展，利用具有良好選擇性以及反應(yīng)條件溫和的生物催化工藝實(shí)現(xiàn)脂肪酸的功能化衍生和精細(xì)化增值正受到越來越多的關(guān)注。

對脂肪酸進(jìn)行一系列氧化降解、加氫還原以及環(huán)氧化、胺化等反應(yīng)可以生成很多種脂肪酸衍生物，可用于生產(chǎn)各種各樣的化學(xué)品。目前大多數(shù)油脂類化學(xué)品的生產(chǎn)采用了高溫高壓、強(qiáng)酸或重金屬催化劑、有毒催化劑（如臭氧）等苛刻的反應(yīng)條件，且步驟煩瑣、選擇性較差[5]，所以人們越來越傾向于尋求一種更綠色和可持續(xù)的新工藝，以便采用更溫和的反應(yīng)條件，減少安全隱患以及減少工業(yè)廢物，降低對環(huán)境的影響[6]。因此，亟需開發(fā)新的反應(yīng)路徑為脂肪酸的衍生化提供新的思路，以提升脂肪酸的應(yīng)用價值。

如圖1所示，采用生物酶催化法，以植物油中豐富的油酸、亞油酸或蓖麻油酸等長鏈不飽和脂肪酸為底物，通過水合酶、醇脫氫酶、單加氧酶、脂氧合酶、酯酶、脂氫過氧化物裂解酶、胺脫氫酶以及轉(zhuǎn)氨酶等多酶協(xié)同催化，可生成不同鏈長的二醇、二酸、二胺以及ω?氨基脂肪酸(ω?AmFAs)、ω?羥基脂肪酸(ω?HFAs)等脂肪酸衍生物，它們可以作為單體合成聚酰胺、聚酯等系列聚合物[7?8]，用于生產(chǎn)塑料、潤滑油、香料、涂料、燃料等產(chǎn)品，此外它們在一些藥物生產(chǎn)中也是重要的合成前體[9]。本文主要概述了近年來植物油以及長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為中等鏈長(C6～C12)ω?HFAs和ω?AmFAs的各種生物催化路線，重點(diǎn)介紹了目前ω?HFAs 和ω?AmFAs 的酶法合成研究進(jìn)展。

1 ω?羥基脂肪酸

羥基脂肪酸(HFAs)含有羧基以及一個或多個羥基，碳鏈可以是飽和或不飽和的[10]。與普通脂肪酸相比，HFAs 因具有更高的黏度和反應(yīng)活性等特殊性質(zhì)而備受關(guān)注[11]。根據(jù)羥基所處的位置，HFAs 也可以簡單分為α?HFAs,β?HFAs,ω?HFAs 以及中位HFAs。其中，ω?HFAs 由于其羥基連接烴鏈最末端的碳原子，從而為合成高分子材料提供了最長的碳鏈骨架，可用于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的綠色合成纖維[10]。近年來，為擴(kuò)大植物油的高值化利用范圍，植物油中富含的脂肪酸如油酸、亞油酸、蓖麻油酸等被廣泛研究和開發(fā)，主要是應(yīng)用生物催化技術(shù)合成工業(yè)所需的ω?HFAs。

圖1 酶催化脂肪酸轉(zhuǎn)化生成多種功能化合物及其應(yīng)用價值Fig.1 Enzyme?catalyzed conversion of fatty acids into various functional compounds with diverse application values

ω?HFAs 的合成可以分為兩類：脂肪酸的末端C—H 氧化以及脂肪酸碳鏈內(nèi)部的氧化裂解[3,12]。其中，碳鏈末端的C—H 氧化反應(yīng)主要由P450 單加氧酶或烷烴氧化酶AlkBGT 催化；而碳鏈內(nèi)部的氧化裂解反應(yīng)主要由拜耳?維利格單加氧酶(Baeyer?Villiger monooxygenases，BVMOs)或脂氧合酶及裂解酶催化，這也是長鏈不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為中鏈ω?HFAs 中的一個常用反應(yīng)。本節(jié)主要介紹植物油轉(zhuǎn)化為ω?HFAs的多酶級聯(lián)反應(yīng)，匯總了油酸、亞油酸和蓖麻油酸這三大類植物油通過上述第二類反應(yīng)轉(zhuǎn)化為飽和、不飽和ω?HFAs 的生物催化級聯(lián)反應(yīng)（表1）。

1.1 飽和ω-羥基脂肪酸的合成

脂氧合酶可以在亞油酸、亞麻酸等脂肪酸的雙鍵處加氧生成過氧化物，再通過裂解酶斷裂生成末端醛酸。以亞油酸為例，為獲得中間產(chǎn)物9?醛基壬酸以進(jìn)一步合成9?羥基壬酸及其衍生物，Otte 等[13]運(yùn)用來自Solanum tuberosum 的9S?脂氧合酶(9S?lipoxygenase)StLOX1 以及來自Cucumis melo 的9/13?裂解酶(9/13?hydroperoxide lyase)Cm9/13HPL，將亞油酸轉(zhuǎn)化為9?醛基壬酸(圖2)。由于9/13HPL 具有嚴(yán)格的S?構(gòu)型選擇性，所以需要采用高S?選擇性的LOX 進(jìn)行催化。該研究發(fā)現(xiàn)，隨著底物上載量的提高和反應(yīng)時間的延長，可能導(dǎo)致中間產(chǎn)物的異構(gòu)化，使得產(chǎn)物得率明顯降低。

脂氧合酶催化亞油酸不僅可以催化C9位也可以C13位加氧生成過氧化氫衍生物，然而其作為植物酶在微生物細(xì)胞中表達(dá)量低、活性差，影響了其在重組微生物細(xì)胞中的生物轉(zhuǎn)化效率，因此篩選高活力的LOX 具有重要的研究意義。2020 年，本課題組[20]報道了三個新的來源于藍(lán)藻的脂氧合酶，分別是CaLOX (來源于Calothrix sp. HK?06)、RiLOX (來源于 Rivularia sp. PCC 7116) 和TbLOX ( 來 源 于Tolypothrix bouteillei VB521301)，其中CaLOX 和RiLOX是迄今報道中活性最高的LOXs，純酶的比活力分別達(dá)到73.1 和68.8 U·mg?1。RiLOX 在大腸桿菌中異源表達(dá)時，體系酶活可以達(dá)到38.3 U·ml?1，它催化亞油酸生成13?過氧氫?9,11?(Z,E)?十八碳二烯酸(13?HPOD)，后續(xù)使用NaBH4還原可得到13(S)?羥基?9,11?(Z,E)?十八碳二烯酸(13?HODE)，時空產(chǎn)率高達(dá)1056 g·L?1·d?1。

表1 植物油轉(zhuǎn)化生成ω-羥基脂肪酸的多酶級聯(lián)反應(yīng)Table 1 Multienzyme cascades to ω-HFAs from plant oils

圖2 生物催化亞油酸生成9?醛基壬酸Fig.2 Preparation of 9?oxononanoic acid from linoleic acid by LOX and HPL

拜耳?維利格單加氧酶(Baeyer?Villiger monooxygenases, BVMOs)可以活化C—C 鍵進(jìn)行擴(kuò)環(huán)，在酮羰基與鄰近烴基之間引入一個氧原子而得到相應(yīng)的酯，并且具有出色的位置和立體選擇性，因而被廣泛應(yīng)用于多種酮類化合物的氧化反應(yīng)中[21]。2013 年，Song 等[14]將來源 于Stenotrophomonas maltophilia 的油酸水合酶(oleate hydratase,OhyA)、來源于M. luteus 的醇脫氫酶ADH 以及P. putida KT2440 的單加氧酶PpBVMO 進(jìn)行基因共表達(dá)，實(shí)現(xiàn)油酸向中間酯的轉(zhuǎn)化，再通過P. fluorescens 酯酶的水解，生成正壬酸以及ω?羥基壬酸(圖3)。以橄欖油中提取的油酸為底物(11.3 mmol·L?1)，最終獲得了6.7 mmol·L?1ω?羥基壬酸，得率為60%。然而，用來源于P.fluorescens DSM 50106 的“非常規(guī)”PfBVMO 替代PpBVMO 進(jìn)行反應(yīng)時，生成的產(chǎn)物完全不同；由于PfBVMO在羰基的另一側(cè)引入氧原子，導(dǎo)致最終的產(chǎn)物為正辛酸以及α,ω?癸二酸。這兩個區(qū)域選擇性恰好相反的BVMO 均由Bornscheuer 等[22?23]最先發(fā)現(xiàn)，采用不同選擇性的BVMOs有利于豐富脂肪酸催化途徑產(chǎn)物的多樣性。2018 年，本課題組[24]通過基因挖掘和功能篩選得到來源于銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa 的PaBVMO，該酶對碳原子數(shù)在17～20 的長鏈酮酸(10?羰基十七烷酸、9?羰基十八烷酸、10?羰基十八烷酸、10?羰基十九烷酸、10?羰基二十烷酸)的區(qū)域選擇性均大于90/10 (非常規(guī)酯酸/常規(guī)酯酸，摩爾比)，顯著高于所用探針酶PfBVMO，表現(xiàn)出較高的“非常規(guī)”區(qū)域選擇性，更加適合植物油的生物轉(zhuǎn)化路徑，可以顯著減少副產(chǎn)物，提高底物利用率。

圖3 油酸的兩條不同生物轉(zhuǎn)化途徑Fig.3 Different biotransformation pathways for oleic acid

2016 年，Koppireddi 等[15]采 用 油 酸 水 合 酶(OhyA)、醇脫氫酶ADH 以及單加氧酶PpBVMO 實(shí)現(xiàn)油酸向酯的轉(zhuǎn)化后，用化學(xué)法對酯進(jìn)行水解，而不用酯酶，因?yàn)樗猱a(chǎn)物正壬酸對細(xì)胞具有毒害作用[25]。此外還發(fā)現(xiàn)，級聯(lián)酶在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)水平影響油酸向酯的生物轉(zhuǎn)化速率，因此，將油酸水合酶和單加氧酶分別構(gòu)建重組細(xì)胞，采用雙細(xì)胞體系進(jìn)行反應(yīng)，明顯提高了轉(zhuǎn)化率以及反應(yīng)速率，30 mmol·L?1油酸，9 h 后可轉(zhuǎn)化為25 mmol·L?1酯，酯生成速率達(dá)2.8 mmol·L?1·h?1。

同年，Jeon 等[16]為了進(jìn)一步強(qiáng)化脂肪酸到酯的轉(zhuǎn)化率，在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用Seo 等[26]構(gòu)建的工程化BVMO 酶(E6BVMO)，并對位于細(xì)胞外膜的一個長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FadL進(jìn)行過表達(dá)，相比于無FadL的雙細(xì)胞體系，油酸到酯的轉(zhuǎn)化效率提高了4 倍，由5 mmol·L?1油酸可以獲得3.9 mmol·L?1酯，酯的生成速率達(dá)1.2 mmol·L?1·h?1。增加細(xì)胞添加量，底物上載量可以提高到60 mmol·L?1，8 h 可獲得42 mmol·L?1酯，酯的 生 成速 率達(dá)5.3 mmol·L?1·h?1。最后采用來源于Thermomyces lanuginosus 的脂肪水解酶(TLL)對酯進(jìn)行水解，獲得壬酸以及9?羥基壬酸。之后，在前期研究基礎(chǔ)上[14,27]，也對亞油酸進(jìn)行了轉(zhuǎn)化(圖4)，與油酸轉(zhuǎn)化不同的是，篩選獲得一新型脂肪酸水合酶OhyA2，5 mmol·L?1亞油酸可以轉(zhuǎn) 化 為4.2 mmol·L?1酯，酯 生 成 速 率 達(dá)1.2 mmol·L?1·h?1。

圖4 亞油酸的生物轉(zhuǎn)化途徑Fig.4 Biotransformation pathway for linoleic acid

2018 年，Seo 等[17]為將產(chǎn)物9?羥基壬酸進(jìn)一步功能化生成α,β?壬二酸，引入對長鏈脂肪酸具有較高氧化活力、來源于Acinetobacter sp.NCIMB9871 的醇/醛脫氫酶(ChnD/ChnE)[28]，對多種植物油(橄欖油、大豆油、微生物油脂)進(jìn)行了整細(xì)胞催化。其中，以市售的橄欖油為底物，首先采用脂肪酶(lipase)對甘油三酯進(jìn)行水解獲得油酸，再采用整細(xì)胞催化劑以及脂肪酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可獲得正壬酸和壬二酸(圖5)：加入3 g·L?1橄欖油，壬酸以及壬二酸的產(chǎn)物濃度可以達(dá)到4.3 mmol·L?1，比產(chǎn)率為3.1 U·g?1CDW。

圖5 以整細(xì)胞及酶催化可再生油脂生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)途徑示意圖Fig.5 Schematic diagram of the enzyme/whole?cell biotransformation system of renewable oils

1.2 不飽和ω-羥基脂肪酸的合成

在油酸與亞油酸的生物轉(zhuǎn)化中，主要生成的是壬酸以及9?羥基壬酸；若使用“非常規(guī)”BVMO，也會生成辛酸和癸二酸。而以蓖麻油酸為底物時，Song等[14]首次將蓖麻油酸轉(zhuǎn)化生成正庚酸以及ω?羥基?9?十 一 烯 酸(ω ?hydroxyundec?9?enoic acid, ω ?HUA)。Jang 等[18]采用來源于M. luteus 的醇脫氫酶、P. putida KT2440 的單加氧酶PpBVMO 以及來源于Pseudomonas fluorescens SIK WI 的酯酶，實(shí)現(xiàn)蓖麻油酸向庚酸以及ω?HUA 的高效轉(zhuǎn)化(圖6)：24 mmol·L?1蓖麻油酸，以3.2 mmol·L?1·h?1的速率最終生成20 mmol·L?1正庚酸以及ω?HUA，轉(zhuǎn)化率＞80%，產(chǎn)物正庚酸和ω?HUA 的產(chǎn)量分別為2.5 g·L?1和4.0 g·L?1。由于觀察到還有中間體酯未完全水解，Cho 等[19]推測可能是由于酯的強(qiáng)疏水性使得其難于被在胞質(zhì)空間表達(dá)的酯酶進(jìn)行高效催化，所以將酯酶與一個信號肽PelB[29]進(jìn)行融合表達(dá)，使其能被該疏水肽運(yùn)輸?shù)街苜|(zhì)空間中，并去除該序列中信號肽酶的識別位點(diǎn)，使酯酶錨定在胞質(zhì)膜上進(jìn)行催化，雖然融合蛋白的酶活性有所下降，但是產(chǎn)物ω?HUA 的生成速率以及產(chǎn)物得率均有效提高，產(chǎn)量可達(dá)4.7 g·L?1。

圖6 蓖麻油酸的生物轉(zhuǎn)化途徑Fig.6 Biotransformation pathway for ricinoleic acid

由于壬酸等脂肪酸產(chǎn)物會破壞細(xì)胞的電子傳遞鏈和氧化磷酸化[30]，且過量的酸在細(xì)胞體內(nèi)會造成酸化，影響胞內(nèi)pH，從而對細(xì)胞的生理和代謝造成影響。為實(shí)現(xiàn)植物油生物轉(zhuǎn)化過程的工業(yè)應(yīng)用，以及高生產(chǎn)率、高產(chǎn)物濃度的目標(biāo)，減少產(chǎn)物對細(xì)胞的毒性影響至關(guān)重要。這可以通過基因工程、代謝工程對細(xì)胞進(jìn)行改造，Woo 等[31]基于GadA/B 的谷氨酸依賴性耐酸(GDAR)系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過催化谷氨酸的脫羧反應(yīng)來清除細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)子，而在大腸桿菌BL21(DE3)中不活躍，因此通過過表達(dá)rcsB和dsrA基因來激活GDAR 系統(tǒng)，從而提高了細(xì)胞對正庚酸的耐酸能力；也可以設(shè)計(jì)水?有機(jī)溶劑雙相反應(yīng)體系，使易溶于有機(jī)溶劑的有毒產(chǎn)物與細(xì)胞實(shí)現(xiàn)有效的隔離[32]，或在反應(yīng)中使用吸附樹脂，對疏水產(chǎn)物進(jìn)行原位回收[33]，從而降低產(chǎn)物對細(xì)胞催化活性的影響。

對于整細(xì)胞催化而言，脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率成為一個重要的限速因素。脂肪酸特別是長鏈脂肪酸需要通過長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FadL 穿過細(xì)胞外膜，然后被膜結(jié)合的脂肪酸?；o酶A 合成酶激活之后，釋放到細(xì)胞溶膠中[28,34]。Jeon 等[35]也通過研究，發(fā)現(xiàn)FadL表達(dá)水平是決定長鏈脂肪酸和羥基脂肪酸整細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素之一，F(xiàn)adL 的過表達(dá)可以提高細(xì)胞對脂肪酸的轉(zhuǎn)化速率，Shin 等[36]通過在大腸桿菌中過量表達(dá)微囊蛋白Caveolin?1，提高細(xì)胞對疏水性底物的內(nèi)吞作用而提高脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)速率。此外，從上述案例中可以發(fā)現(xiàn)，BVMO單加氧酶是脂肪酸轉(zhuǎn)化途徑中的一個限速酶，而其在氧化和熱刺激下的不穩(wěn)定性，以及有限的活力仍然是實(shí)現(xiàn)生物催化劑工業(yè)應(yīng)用中的一個主要障礙。隨著蛋白質(zhì)工程以及酶工程等領(lǐng)域的發(fā)展，可在基因水平上對BVMO 進(jìn)行分子改造，例如通過密碼子優(yōu)化、融合表達(dá)可溶性標(biāo)簽蛋白、分子改造提高酶的比活力以及在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平優(yōu)化基因的表達(dá)等各種手段來增強(qiáng)酶的表達(dá)水平和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[26,37?38]。

2 ω?氨基脂肪酸

ω?氨基脂肪酸(ω?AmFAs)是重要的一類脂肪酸衍生物，具有α?羧基和ω?氨基雙官能團(tuán)，可以進(jìn)一步縮合生成聚酰胺聚合體，是重要的聚酰胺合成單體，例如目前廣泛應(yīng)用的6?氨基己酸、ω?氨基十二烷酸等。聚酰胺即尼龍(nylon,polyamide)，它是含有酰胺基團(tuán)(—CO—NH—)的高聚物總稱，是目前工業(yè)中應(yīng)用廣泛的工程塑料。此外，由于具有良好的綜合性能，包括力學(xué)性能、耐熱性、耐磨損性、耐化學(xué)藥品性和自潤滑性等，且摩擦系數(shù)低，有一定的阻燃性，易于加工[39]，被廣泛用于制作機(jī)械、化工、電器等零件。

圖7 ω?氨基脂肪酸的化學(xué)[41?42]和酶法合成路線Fig.7 Chemical and enzymatic synthesis routes to ω?AmFAs

ω?AmFAs除了作為聚酰胺的重要合成單體外，也具有一定的醫(yī)療方面的應(yīng)用。例如，8?氨基辛酸鹽或其氨基衍生物的單體或組合體作為維生素B12的吸收促進(jìn)劑而研制成口服制劑，可用于預(yù)防或治療維生素B12缺乏癥[40]。此外，在一些抗菌藥物的合成中，為了調(diào)節(jié)酯類化合物的活性、毒性和親脂性，常以ω?AmFAs為基礎(chǔ)插入烷基，更好地促進(jìn)藥物的活性并降低對腸胃的毒性[9]。

2.1 ω-氨基脂肪酸的合成

ω?AmFAs由于其廣泛的應(yīng)用價值，其合成方法一直受到化學(xué)家和生物工程師的關(guān)注。如圖7 所示，是ω?AmFAs 合成中常用的化學(xué)和生物催化路徑。工業(yè)上常采用的化學(xué)路線是臭氧以及金屬鎳催化的氧化還原反應(yīng)，或是烯酸與丙烯腈的交叉復(fù)分解反應(yīng)[43]。在傳統(tǒng)的工業(yè)制備中，還原胺化工藝常使用非均相催化劑，如二氧化硅或氧化鋁負(fù)載金屬催化劑，并在150～210℃的高溫和18～200 bar（1 bar=105Pa）的壓力下進(jìn)行反應(yīng)[44]?；瘜W(xué)合成法的主要優(yōu)點(diǎn)[45]之一是高時空產(chǎn)率，通常具有較高的反應(yīng)速率，所得產(chǎn)物只需經(jīng)過簡單的蒸餾等下游加工，即可獲得較高的分離得率，提高了時空產(chǎn)率。此外，使用的多相催化劑易于循環(huán)再用，并使用廉價的還原劑即氫氣和氨氣，顯著降低了成本。然而，由于反應(yīng)需要高溫等條件，因此需要較大的能源消耗，較高的反應(yīng)溫度難以避免一些副產(chǎn)物的形成，例如仲胺和叔胺等，反應(yīng)選擇性有限。

以脂肪酸為原材料，生產(chǎn)ω?AmFAs的工業(yè)應(yīng)用仍較少[46]。對脂肪酸烷基鏈上的惰性C—H 鍵進(jìn)行官能團(tuán)化是化學(xué)工業(yè)上的一個難點(diǎn)，而隨著生物催化的發(fā)展，生物發(fā)酵以及酶催化(如單加氧酶P450)可以實(shí)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)化。Arkema France[46]通過發(fā)酵工程將油酸轉(zhuǎn)化為二酸，經(jīng)臭氧分解后被還原得到9?醛基壬酸，在Ra?Ni 或者Pd/C[47]的催化下，使用NH3/H2還原胺化生成9?氨基壬酸，如圖8所示。

近年來，隨著生物技術(shù)研究的發(fā)展，越來越多的酶催化被應(yīng)用于ω?AmFAs 的生產(chǎn)研究。根據(jù)起始原料的不同，ω?AmFAs 的生物合成途徑有所不同，如圖7 所示：(1)從游離脂肪酸出發(fā)，通過P450 羥化酶在末端羥化形成ω?HFAs[48];(2)從脂肪酸酯[27]或內(nèi)酯[49]出發(fā)，用酯酶進(jìn)行水解生成ω?HFAs，通過醇脫氫酶氧化生成ω?醛基脂肪酸，再用轉(zhuǎn)氨酶或胺脫氫酶將醛酸胺化生成ω?AmFAs。

對于脂肪酸的生物胺化反應(yīng)，過去的研究主要集中于低分子量的短鏈脂肪酸如乳酸、琥珀酸等[50]。對于長鏈脂肪酸，可以直接胺化植物油生成如10?氨基硬脂酸[51]。然而，以中鏈脂肪酸衍生物為單體合成的一些生物塑料表現(xiàn)出與聚乙烯和其他生物塑料相似甚至更優(yōu)的物理化學(xué)性質(zhì)，但其生物合成目前仍是一項(xiàng)挑戰(zhàn)性的任務(wù)[27]。因此本節(jié)主要介紹近年來中鏈ω?AmFAs的生物合成研究進(jìn)展。

2.2 多酶級聯(lián)催化合成ω-氨基脂肪酸

圖8 化學(xué)/酶法合成9?氨基壬酸Fig.8 Chemical/enzymatic synthesis of 9?aminonanoic acid

表2 多酶級聯(lián)合成不同鏈長的ω-氨基脂肪酸的路線Table 2 Multi-enzymatic synthesis of ω-AmFAs in recombinant E.coli

從上述介紹可以發(fā)現(xiàn)，ω?AmFAs的生物合成涉及多個反應(yīng)，需要多個不同的酶參與。為簡化反應(yīng)步驟，實(shí)現(xiàn)ω?AmFAs 的一步合成，越來越多的生物化學(xué)家致力于研究多酶級聯(lián)反應(yīng)。目前，根據(jù)合成底物的不同，ω?AmFAs的多酶級聯(lián)合成可以分為兩類：一類是從內(nèi)酯或ω?HFAs 生成ω?AmFAs 的多酶級聯(lián)，不需要單加氧酶的參與；另一類是從脂肪酸轉(zhuǎn)化為ω?AmFAs的多酶級聯(lián)，需要一個可以在脂肪酸碳鏈末端進(jìn)行羥化的單加氧酶。表2 對近年來ω?AmFAs的合成研究進(jìn)行了匯總。

2.2.1 由內(nèi)酯或ω?羥基脂肪酸生成ω?氨基脂肪酸的多酶級聯(lián) 從脂肪酸酯出發(fā)，通過酯酶水解生成ω?HFAs，對于一些特殊鏈長的氨基脂肪酸，如6?氨基己酸，也可以通過環(huán)內(nèi)酯的水解獲得ω?HFAs，再通過醇脫氫酶和轉(zhuǎn)氨酶催化生成ω?AmFAs。2014年，Sattler 等[49]設(shè)計(jì)了脫氫與轉(zhuǎn)氨兩步反應(yīng)，并引入丙氨酸脫氫酶實(shí)現(xiàn)輔因子自給自足的生物催化級聯(lián)，使得己內(nèi)酯成功轉(zhuǎn)化為6?氨基己酸(圖9)。為最小化末端6?羥基己酸的形成，將己內(nèi)酯在甲醇存在下，在水溶液中轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酯，以保護(hù)羧基，并首次發(fā)現(xiàn)馬肝酯酶對己內(nèi)酯環(huán)的催化效率最高，最終50 mmol·L?1己內(nèi)酯反應(yīng)20 h后，產(chǎn)物6?氨基己酸的占比達(dá)75%。

圖9 由己內(nèi)酯合成6?氨基己酸的催化路線設(shè)計(jì)Fig.9 Catalytic route of caprolactone to 6?aminocaproic acid

2014 年，以12?羥基硬脂酸為底物，Song 等[27]采用一鍋兩步級聯(lián)催化生成ω?氨基十一烷酸，先采用來自Micrococcus luteus NCTC2665 的醇脫氫酶ADH、來自P. putida KT2440 的單加氧酶BVMO 以及來自P. fluorescens SIK WI 的酯酶將12?羥基硬脂酸轉(zhuǎn)化為正庚酸以及11?羥基脂肪酸，之后加入來源于P.putida GPo1的醇脫氫酶AlkJ以及來自S.pomeroyi的轉(zhuǎn)氨酶，進(jìn)一步將11?羥基十一烷酸轉(zhuǎn)化為11?氨基十一烷酸(圖10)。5 mmol·L?1底物12?羥基硬脂酸，最終轉(zhuǎn)化為2.5 mmol·L?111?氨基十一烷酸，而分離得率只有36%，這是由于AlkJ 會進(jìn)一步過氧化而生成少量(0.7 mmol·L?1)的副產(chǎn)物十一烷二酸。

圖10 多酶級聯(lián)轉(zhuǎn)化12?羥基硬脂酸生成11?氨基十一烷酸Fig.10 Biotransformation pathway of 12?hydroxystearic acid into 11?aminoundecanoic acid

圖11 生成ω?氨基脂肪酸的反向平行級聯(lián)設(shè)計(jì)Fig.11 Design of two interconnected two?step sequences,parallel anti?sense cascade,to produce ω?AmFAs

使用同一轉(zhuǎn)氨酶，2018 年，Sung 等[52]將其與來自Synechocystis sp. slr1192 的醛還原酶(AHR)偶聯(lián)，并以氨基供體芐胺為輔底物，設(shè)計(jì)了涉及兩步反應(yīng)的平行級聯(lián)[56]，成功將不同鏈長(C6～C16)的ω?HFAs轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω?AmFAs，同時生成副產(chǎn)物苯甲醇(圖11)，采用共表達(dá)的整細(xì)胞進(jìn)行催化反應(yīng)，在100 mmol·L?1底物上載量下，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到80%～95%。

2.2.2 脂肪酸轉(zhuǎn)化為ω?氨基脂肪酸的多酶級聯(lián)從脂肪酸出發(fā)合成ω?AmFAs，則需要加氧酶和醇脫氫酶進(jìn)行末端加氧以及脫氫得到醛酸，才能進(jìn)一步胺化生成氨基酸，而加氧酶往往是整條路線中的限速酶。目前，烷烴的選擇性末端羥化仍然是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)[57]，中鏈脂肪酸末端羥化反應(yīng)主要用到的是細(xì)胞色素P450 單加氧酶(如CYP153)[58]以及烷烴氧化酶AlkB[59]。烷烴氧化酶體系A(chǔ)lkBGT 是由三個酶構(gòu)成的，單加氧酶AlkB以及兩個負(fù)責(zé)電子傳遞的輔助蛋白AlkG 和AlkT[59]。2011 年，Schrewe等[60]將AlkBGT 在大腸桿菌中異源表達(dá)，對不同鏈長(C5～C12)的脂肪酸甲酯進(jìn)行了研究，其中對壬酸甲酯的末端羥化活性最高，達(dá)到104 U·g?1CDW。在此基礎(chǔ)上，將該單加氧酶體系與來自Chromobacterium violaceum 的轉(zhuǎn)氨酶CV2025相結(jié)合[53]，通過重組整細(xì)胞反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了十二烷酸甲酯的末端胺化(圖12)，2.9 mmol·L?1底 物 十 二 烷 酸 甲 酯，90 min 后 生 成0.13 mmol·L?1ω?氨基十二烷酸甲酯，最大的胺形成速率僅1.5 μmol·min?1·g?1CDW。由于單加氧酶AlkBGT導(dǎo)致了中間產(chǎn)物醛的過氧化，生成了相同產(chǎn)物濃度的副產(chǎn)物酸，且底物水溶性差也是導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率低的重要原因。此外，認(rèn)為可以進(jìn)一步通過催化劑工程來提高疏水性底物的可獲得性，并應(yīng)用雙相反應(yīng)體系來解決該反應(yīng)中底物或產(chǎn)物對酶的抑制作用。

圖12 十二烷酸甲酯的末端氨基功能化Fig.12 Amination of ω?functionalized methyl dodecanoate

為了避免AlkB 可逆反應(yīng)中中間產(chǎn)物的積累，Kirmair 等[61]使用了與AlkB 同一來源的醇脫氫酶AlkJ，并進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的研究，該酶能不可逆催化醇氧化生成醛，然而，在反應(yīng)中也同樣會過氧化催化生成副產(chǎn)物。2016年，Ladkau等[54]在上述Schrewe的AlkBGT 體系催化研究基礎(chǔ)上，引入外膜蛋白AlkL，提高了細(xì)胞對疏水性底物的攝取以及AlkBGT的氧化活力，轉(zhuǎn)氨酶活力提高了7.3 倍，達(dá)11 U·g?1CDW，生成0.55 mmol·L?1ω?氨基十二烷酸甲酯(基于2.9 mmol·L?1底物十二烷酸甲酯)。為減少外源添加高濃度L?丙氨酸的成本，通過借鑒Sattler 的研究[49]，引入了丙氨酸脫氫酶AlaDH 實(shí)現(xiàn)L?丙氨酸的胞內(nèi)循環(huán)，同時引入催化不可逆反應(yīng)的醇脫氫酶AlkJ，明顯增加了最終產(chǎn)物ω?氨基十二烷酸甲酯的濃度。

除了AlkBGT 單加氧酶體系，細(xì)胞色素P450 中的CYP153 亞家族也具有末端羥化反應(yīng)的催化能力，并具有較高的末端區(qū)域選擇性。2018 年，Ahsan等[48]發(fā)現(xiàn)了一新型單加氧酶，來自Mycobacterium parascrofulaceum 的CYP153A (MprCYP153A)，采 用CamAB 為氧化還原伴侶，對十二氨基烷酸具有較高的轉(zhuǎn)化率(1 mmol·L?1底物，轉(zhuǎn)化率＞99%)。此外，將醇脫氫酶AlkJ 與來自M. loti 的轉(zhuǎn)氨酶mll 1207 ω?TA 進(jìn)行共表達(dá)后，將MprCYP153A/CamAB 與AlkJ/mll 1207 ω?TA 雙細(xì)胞進(jìn)行一鍋反應(yīng)[圖13(a)]，苯乙胺為氨基供體，催化2 mmol·L?1十二烷酸，6 h 后生成0.6 mmol·L?1ω ?氨 基 十 二 烷 酸。為 了 簡 化CYP153A 的羥化反應(yīng)，該課題組[55]將來自Alcanivorax borkumensis SK2的CYP153A13與天然自給自足的細(xì)胞色素P450 還原酶(CPR)進(jìn)行融合表達(dá)，構(gòu)建了自給自足型人工P450酶(CYP153A13BM3CPR)，將該酶與醇脫氫酶AlkJ 及轉(zhuǎn)氨酶Sp ω?TA 一起共表達(dá)后，可以實(shí)現(xiàn)十二烷酸到ω?氨基十二烷酸的整細(xì)胞催化[圖13(b)]。通過優(yōu)化反應(yīng)體系，反應(yīng)24 h后，圖13(b)體系可以從10 mmol·L?1十二烷酸中獲得1.48 mmol·L?1ω?氨基十二烷酸，產(chǎn)物濃度相比于圖13(a)體系提高了5倍。

圖13 ω?氨基十二烷酸的整細(xì)胞合成Fig.13 The biosynthesis of ω?amino dodecanoic acid(ω?AmDDA)from dodecanoic acid(DDA)

從上述案例中可以發(fā)現(xiàn)，ω?醛基脂肪酸的胺化反應(yīng)主要采用了ω?轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行催化。轉(zhuǎn)氨酶以5?磷酸吡哆醛(PLP)為輔因子，能可逆催化羰基與氨基之間的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)[62]。然而，轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)中的熱力學(xué)平衡問題影響了轉(zhuǎn)氨酶的催化效率[63]。為推動反應(yīng)平衡向產(chǎn)物形成方向移動，可以通過反應(yīng)工程手段來實(shí)現(xiàn)[64]，例如加入大幅過量的氨基供體(如異丙胺)；原位移除產(chǎn)物或副產(chǎn)物；或如圖9 偶聯(lián)其他酶促反應(yīng)，使反應(yīng)副產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為原始的輔底物加以循環(huán)利用，或生成其他易于移除的成分[65]。因此，在轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用中，選擇合適的酶并應(yīng)用一個合適的推動平衡策略至關(guān)重要。

近日，Mutti 課題組[66]報道了一株由賴氨酸脫氫酶改造而來的胺脫氫酶(AmDH)，對來源于G.stearothermophilus 菌株的野生型賴氨酸脫氫酶進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬并基于其結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行分子改造，獲得的最佳變體LEAmDH?V1 (F173A)不僅具有較好的熱穩(wěn)定性(Tm= 69℃)，并且可以催化己醛酸生成6?氨基己酸，實(shí)現(xiàn)50 mmol·L?1己醛酸的完全胺化(轉(zhuǎn)化率＞99%)。此外，2019 年，Citoler 等[67]將羧酸還原酶(carboxylic acid reductases, CARs)與轉(zhuǎn)氨酶級聯(lián)，對C6～C18的飽和或不飽和脂肪酸進(jìn)行酶法胺化，將脂肪酸的羧基還原為醛基后，胺化生成脂肪胺。此外值得一提的是，人們發(fā)現(xiàn)真菌中存在一類非特異性過氧化物酶(unspecific peroxygenases,UPOs)[68]，與細(xì)胞色素P450單加氧酶的功能類似，對脂肪酸的惰性碳鏈也具有選擇性氧化的能力，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了來源于Marasmius rotula 的UPO 酶基因在大腸桿菌中的異源過量表達(dá)[69]，這為中長鏈脂肪酸的生物羥化及胺化反應(yīng)提供了新的路徑。

3 總結(jié)與展望

從植物油或其脂肪酸出發(fā)，通過非天然的微生物酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)，可以生產(chǎn)高附加值的ω?HFAs 與ω?AmFAs，可用于生產(chǎn)化妝品、塑料、工業(yè)材料等，具有光明的應(yīng)用研究和開發(fā)前景。在中鏈ω?HFAs與ω?AmFAs 的研究中，主要應(yīng)用了油酸水合酶、醇脫氫酶、BVMO 單加氧酶、酯酶、P450 羥化酶以及轉(zhuǎn)氨酶等催化元件，然而目前大多數(shù)的生物催化反應(yīng)仍停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，還無法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，這主要是由于酶的穩(wěn)定性不足以及催化活力還較低，尤其是BVMO 單加氧酶和P450羥化酶成為主要的限速瓶頸。此外，大腸桿菌的低耐受性、底物的強(qiáng)疏水性和產(chǎn)物對細(xì)胞的高毒性，也是目前底物上載量低、生產(chǎn)強(qiáng)度較低的主要原因。

從上述案例可以發(fā)現(xiàn)，ω?HFAs 與ω?AmFAs 的生物催化合成普遍應(yīng)用了多酶級聯(lián)催化的生物反應(yīng)過程，且采用整細(xì)胞或者粗酶液在一個反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行體內(nèi)或體外級聯(lián)反應(yīng)，這有助于實(shí)現(xiàn)輔因子的有效自我循環(huán)，并避免了中間體的分離和純化，跳過了煩瑣耗時的中間步驟，避免了中間產(chǎn)物的積累，可以促使可逆反應(yīng)的完成[70]，以及最大限度地減少了用于萃取和純化的有機(jī)溶劑用量，具有較高的原子經(jīng)濟(jì)性和較低的環(huán)境影響因子[71]，工業(yè)化應(yīng)用潛力巨大。然而，多酶級聯(lián)反應(yīng)涉及多個反應(yīng)與酶，相較于單步反應(yīng)更為復(fù)雜，在實(shí)際應(yīng)用中需要考慮多種因素。多種異源酶之間的相互協(xié)調(diào)以及反應(yīng)條件相互兼容是多酶級聯(lián)中的關(guān)鍵問題，也是一個頗具挑戰(zhàn)性的難題[72]。對多酶共表達(dá)的整細(xì)胞體系，如何調(diào)節(jié)活性酶的表達(dá)比例尤為重要，目前可用的手段是通過使用拷貝數(shù)不同的載體，或者優(yōu)化啟動子強(qiáng)度和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)等技術(shù)，實(shí)現(xiàn)多個酶基因的協(xié)調(diào)可控表達(dá)[73]。

因此，為了提高ω?HFAs 與ω?AmFAs 作為工業(yè)產(chǎn)品的潛力，人們?nèi)孕枰⒅靥岣呒壜?lián)酶的穩(wěn)定性以及催化效率，提高微生物細(xì)胞的耐受性，對限速酶在解析其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上進(jìn)行分子改造，以克服脂肪酸生物轉(zhuǎn)化中的瓶頸問題；并且在多酶級聯(lián)反應(yīng)體系中，就如何減少中間產(chǎn)物的積累，加快物料的傳遞和控制平衡問題，需要根據(jù)反應(yīng)類型以及產(chǎn)品的不同，進(jìn)行系統(tǒng)性工程優(yōu)化和應(yīng)用研究，需要考慮包括生物轉(zhuǎn)化途徑的設(shè)計(jì)、級聯(lián)酶催化元件的篩選以及分子工程改造，多酶表達(dá)之間的平衡協(xié)調(diào)以及系統(tǒng)工程等各方面的因素[74]，構(gòu)建一個高效的工程化整細(xì)胞生物催化劑，以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用。