何天基 葛 波

(桂林醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院泌尿外科，桂林 541199)

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)是腫瘤細胞和間質(zhì)組織細胞之間雙向、動態(tài)、錯綜復雜的作用網(wǎng)絡(luò)。因此，充分研究TME中的每一種細胞類型，對明確腫瘤發(fā)生和進展過程中的腫瘤生物學與分子機制具有重要意義。免疫細胞如淋巴細胞、樹突狀細胞、嗜中性粒細胞、自然殺傷細胞(natural killer cells，NK)和肥大細胞是與腫瘤細胞相互作用的重要細胞，是復雜微環(huán)境網(wǎng)絡(luò)的主要參與者[1]。間質(zhì)組織也是參與腫瘤發(fā)生的重要元素，由成纖維細胞、肌成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、免疫細胞和細胞外基質(zhì)組成，其中成纖維細胞是其主要成分，成纖維細胞分泌的多種因子可導致更具侵襲性的癌癥表型[2]。Rosenberg等[3]于1986年從荷瘤小鼠組織中發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lympho-cytes,TILs)并命名。TILs是腫瘤組織中一類特殊淋巴細胞，主要包括T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞等，是TME的主要構(gòu)成部分，可通過不同細胞間的相互作用影響TME，從而直接或間接影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展而發(fā)揮抗腫瘤效應。此外，TILs建立復雜的細胞間相互作用網(wǎng)絡(luò),有助于維持免疫抑制性微環(huán)境，促進免疫逃逸，引發(fā)腫瘤。TILs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預后中具有重要意義，已成為近年研究熱點。研究表明原位活化的T細胞、B細胞在機體富集時可改善預后，影響相關(guān)腫瘤進程，在乳腺癌、黑色素瘤等實體腫瘤的研究中預后良好[4，5]。

1 TILs的概念及評判標準

1.1TILs概念 TILs是腫瘤組織中浸潤的一類特殊淋巴細胞，存在兩組相互作用的細胞，一組以CD4+輔助性T細胞(Th1)、CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)、CD4+細胞、NK細胞、巨噬細胞M1及樹突狀細胞(DC)Ⅰ型等通過特異性免疫應答抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移等過程；另一組主要通過調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)、CD4+Th2細胞、巨噬細胞M2、樹突狀細胞Ⅱ型及其他髓系來源的相關(guān)抑制細胞等免疫抵抗方式導致腫瘤免疫逃逸。有報道指出當腫瘤細胞中的程序性死亡受體-配體1(programmed cell death-ligand，PD-L1)與機體CTL中的程序性死亡受體1(programmed death 1，PD-1)結(jié)合后CTL可能失活或凋亡，可能有助于TILs中抗腫瘤效應性T細胞凋亡，導致腫瘤免疫逃逸[6,7]。TILs的主要成分包括約75%的CD3+T淋巴細胞、約20%的B淋巴細胞、不到10%的單核細胞和NK細胞；對腫瘤增殖轉(zhuǎn)移起抑制作用的細胞仍以T淋巴細胞為主，是機體持續(xù)抗腫瘤免疫應答的關(guān)鍵因素[8]。

1.2TILs判定標準 TILs分為腫瘤內(nèi)浸潤性淋巴細胞和間質(zhì)浸潤性淋巴細胞，其主要研究方法為：①通過對蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色的病理玻片進行形態(tài)學觀察，采取定量或半定量標準判斷腫瘤內(nèi)浸潤的相關(guān)淋巴細胞，但其判斷標準受病理科醫(yī)師主觀因素影響較大[9]。②免疫組織化學(immunohisto-chemistry，IHC) 法標記各種免疫細胞，如CTL、CD4+Th、FOXP3+、Treg、NK、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞，但由于細胞種類繁多，所需標記細胞數(shù)量較大，細胞間抗體染色對觀察效果有影響；IHC切片還可運用數(shù)字化方式精確定量分析腫瘤組織中免疫細胞，此方法已在多項研究中得到證實[10]。③通過多重免疫熒光可識別各種免疫細胞亞型，并可對亞型免疫細胞成分和分布進行定量分析，但因其費效較低，數(shù)據(jù)分析及存取技術(shù)要求較高，尚不能在臨床上大規(guī)模應用[11]。④流式細胞術(shù):通過單克隆抗體可對單個細胞或其他生物粒子進行多參數(shù)、快速的定量分析，能夠在短時間內(nèi)分析上萬個細胞，同時從一個細胞中測得多個參數(shù)，具有速度快、精度高、準確性好等優(yōu)點，但因其只能分析新鮮組織，且不能分析免疫細胞的分布情況，故其在TILs的研究中受限[12]。其他方法還有mRNA表達譜檢測、CIBERSORT軟件(https://cibersort.stanford.edu/)分析TILs、Opal/TSA多標記免疫熒光技術(shù)等，研究方法種類多，尚缺乏統(tǒng)一的判斷標準[13-15]。2014年國際腫瘤浸潤淋巴細胞協(xié)作組(International Working Group，IWG)擬訂了以腫瘤內(nèi)TILs百分比率評判TILs表達的評估辦法，具體標準見文獻[16]。隨著技術(shù)的進步及對TILs認識的加深，研究人員嘗試將相關(guān)機器及軟件用于TILs判定。Saltz等[17]用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)計算法對圖像分類染色，得到卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (CNN) 識別 TILs 的分布情況，從而得到TCGA中13種腫瘤類型的HE圖像的TIL映射，如圖1；該團隊還使用開源軟件編寫了名為TIL-Map的基于WEB的軟件，用于圖像預測結(jié)果的修改。

圖1 卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)計算識別 TILs 的分布[17]Fig.1 Convolutional neural network calculation to identify distribution of TILs[17]

2 TILs的作用機制

T淋巴細胞在腫瘤免疫中起重要作用，以CTL為主，其Ⅰ類MHC對腫瘤抗原有限制性和特異性結(jié)合激活時產(chǎn)生穿孔素及其他細胞毒素使腫瘤細胞死亡而不損傷正常細胞，具體的作用機制為：①直接接觸殺傷：TILs的T淋巴細胞受TCR和CD28雙刺激信號后激活為效應T淋巴細胞，從而接觸靶細胞，殺滅腫瘤細胞或通過自身分泌的干擾素等相關(guān)因子消滅靶細胞；② 活化的CTL高表達FasL，與靶細胞表面Fas抗原結(jié)合誘導靶細胞凋亡；③穿孔素(performing protein，PFP)/ 顆粒酶 B(GranB)介導的細胞凋亡：在鈣離子作用下，腫瘤細胞表面會存在多聚PFP相關(guān)的“孔道”，通過不同的滲透壓或端粒酶間協(xié)同作用促進靶細胞融解或凋亡；④TILs分泌淋巴毒素直接殺傷靶細胞：如在TNF-α、IFN-γ、IL-2等介導下靶細胞出現(xiàn)的融解與凋亡[18]；CD4+Th細胞的一個亞群對于CTL增殖和功能發(fā)揮至關(guān)重要。NK細胞不具MHC限制性，且無需抗原事先致敏，即可釋放PFP、顆粒酶和細胞因子消除腫瘤細胞。這些淋巴細胞是細胞抗腫瘤免疫的中介細胞。B細胞在被抗原特異性激活后可形成產(chǎn)生抗體(Ab)的漿細胞，從而介導體液抗腫瘤免疫。腫瘤治療中，是T細胞還是B細胞起主要作用尚存爭論。在抗體治療腫瘤期間，NK細胞的抗腫瘤免疫活性很大程度上被認為是在具有抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的情況下發(fā)揮作用的。因此，細胞的協(xié)同作用對抗腫瘤反應的發(fā)生至關(guān)重要。在回顧性研究中，腫瘤組織中高表達CD4+Th1的細胞均具有較好預后，其復發(fā)、轉(zhuǎn)移等風險均低于低表達者，提示T細胞在腫瘤免疫應答中不可或缺。巨噬細胞作為初始抗炎的主要細胞，在清除受損組織和細胞壞死碎片及相關(guān)病原體等方面起重要作用，但其抗腫瘤機制仍需深入研究，其他類型的浸潤性免疫細胞也有待進一步研究。

3 TILs在泌尿系腫瘤中的研究

3.1TILs在腎癌中的研究 免疫療法較早應用于晚期或轉(zhuǎn)移性腎癌術(shù)后輔助治療，以IFN、IL-2輔助治療最為常見，但文獻報道其有效率不足15%[19]。伊匹單抗是抗細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)的阻斷抗體，2018年歐盟及FDA首次批準其聯(lián)合用于中、高危晚期腎細胞癌(RCC)患者的一線治療，主要基于CheckMate-214 Ⅲ期臨床研究的結(jié)果[20]。納武利尤單抗與伊匹木單抗聯(lián)合治療相較于舒尼替尼單獨治療可明顯延長總生存時間(overall survival，OS)，死亡風險降低37%(HR=0.63，P<0.000 1)，截至目前，其客觀緩解率為(41.6% vs 26.5%，P<0.000 1)，治療組具有更高完全緩解率(9.4% vs 1.2%，P<0.000 1)，此外治療組所發(fā)生的3或4級不良事件更少(65% vs 76%，P<0.001)，該方案極大促進了免疫療法的進展[20]。Iida等[21]評估了87例腎癌根治術(shù)后標本的TILs概況，結(jié)果顯示CD276+和Foxp3+TILs的高計數(shù)為根治性腎切除術(shù)后轉(zhuǎn)移和局部復發(fā)預后不良的獨立因素(P=0.033，P=0.006)，且高CD276+TILs計數(shù)與術(shù)前血清TNF-α和IFN-γ水平相關(guān)(P=0.027，P=0.035)。Zhu等[22]對135例腎透明細胞癌患者進行了生存率分析，TC-PD-L1陽性患者被分為有或無CD8+T細胞時，存在更明顯的預后差異(P<0.05)。Ghatalia等[23]研究表明術(shù)后復發(fā)的RCC與低T細胞浸潤、低適應性免疫反應和高中性粒細胞基因表達有關(guān)。Lin等[24]通過酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)舒尼替尼治療 108例轉(zhuǎn)移性腎細胞癌(mRCC)，IHC法觀察腫瘤浸潤性B淋巴細胞(TIBs)，并評估其臨床病理學特征，結(jié)果顯示TIBs陽性浸潤患者對舒尼替尼治療反應更好(P=0.006)，OS更長(P<0.001)，無進展生存期(P=0.028)，且TIB與CD8+TIL正相關(guān)(P<0.001)，2種細胞高浸潤患者顯示出更好的OS(P=0.015)，因此TIB密度不僅是mRCC患者的獨立預后因素，也是TKI治療的預測標志，其可在mRCC募集和激活CD8+TILs以增強抗腫瘤能力。

3.2TILs在膀胱癌中的研究 卡介苗(BCG)作為免疫療法早已應用于高危組非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)，療效確切，復發(fā)率低，但存在結(jié)核擴散、價格高昂等缺點，其作用機制可能與TILs相關(guān)。Kates等[25]使用6個療程的BCG治療實驗大鼠，結(jié)果顯示CD4+細胞比例提高49%(P=0.003)，CD8+細胞比例下降28%(P=0.019)；與未治療組相比，BCG引起CD4+淋巴細胞總比例提高74%(P<0.001)，提示BCG誘導膀胱T細胞募集，表明T細胞活化劑與BCG結(jié)合可能改善臨床預后。Huang等[26]對259例接受鉑類化療的轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌(mUC)患者進行免疫組化研究，其中179例(69%)高表達TILs，80例(31%)低表達TILs，2組中位OS分別為15.7和6.7個月(P<0.001)，表明高表達TILs患者具有較好預后；Chen等[27]基于PD-L1和CD8+T細胞浸潤的mUC腫瘤微環(huán)境的多組學觀察分析腫瘤微環(huán)境與免疫基因相關(guān)性，為膀胱癌分類及治療提供新思路。Rouanne等[28]回顧性分析了147例行TURBt術(shù)的pT1G3 NMIBC患者，其中82例患者基質(zhì)TILs較高，與腫瘤浸潤深度及變異組織學癌癥呈正相關(guān)(P=0.01)。對于癌癥特異生存率分析，高(≥10%)與低(<10%)基質(zhì)TILs風險比為1.70(95%CI為0.7～3.9，P=0.2)，表明TILs在NMIBC中可能與浸潤深度有關(guān)，但其與預后關(guān)系尚不明確。Liu等[29]共納入了102例病理診斷為膀胱癌的患者，通過免疫組織化學標記中性粒細胞和CD8+T細胞TILs與存活率呈正相關(guān)(P<0.01)。齊奧等[30]通過建立小鼠皮下瘤模型研究氧化鐵納米顆粒通過誘導巨噬細胞產(chǎn)生活性氧進而抑制膀胱癌細胞的種植與生長,有望成為新型膀胱灌注藥物。近年來過繼性免疫治療(adoptive cell transfer therapy，ACT)成為腫瘤微環(huán)境的研究熱點，Poch等[31]通過收集原發(fā)性膀胱腫瘤或者存在淋巴結(jié)(LN)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，并以高劑量IL-2繁殖4周后行流式細胞術(shù)對擴展的TIL進行表型分析，結(jié)果顯示70%原發(fā)性腫瘤和所有LN轉(zhuǎn)移瘤顯示出TIL擴增，其中擴增的TIL主要為CD3+和CD8+T細胞，具有潛在的臨床治療前景，但其作用機制有待進一步研究。

3.3TILs在前列腺癌中的研究 Hardenberg等[32]應用IHC分析了39例前列腺癌患者神經(jīng)內(nèi)分泌分化的石蠟包埋組織，其中37.5%標本中腫瘤浸潤淋巴細胞≥10%，與生存分析結(jié)合均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺(mCRPC)對抗免疫檢查點阻斷具有對抗性，Mo等[33]通過IHC法分析了73種原發(fā)性前列腺癌和7種去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)中PD-L1的表達，結(jié)果顯示PD-L1僅在1種原發(fā)性前列腺癌患者的腫瘤細胞中表達，而在CRPC中均未表達，PD-L1+腫瘤相關(guān)神經(jīng)的密度與CD8+TAL密度呈負相關(guān)，神經(jīng)免疫相互作用可能對免疫抑制微環(huán)境起促進作用。Anker等[34]研究顯示患者來源的前列腺特異性細菌CP1與抗PD-1免疫療法相結(jié)合，CP1可通過激活的CD8+T細胞、Th17細胞、成熟樹突狀細胞、M1巨噬細胞和NK細胞導致免疫原性細胞死亡，并使其他耐藥癌癥對免疫治療敏感。檢查點抑制劑對包含稀有腫瘤浸潤淋巴細胞的免疫“冷”腫瘤(如前列腺癌)效果欠佳，因此未來如何激活前列腺癌組織中相關(guān)免疫細胞發(fā)揮抗腫瘤作用仍有待進一步探索。

4 結(jié)語

隨著對TILs研究的不斷深入，其作為潛在治療靶點研究仍存在較多困難，如TILs結(jié)果評判、TILs的內(nèi)分類及分離腫瘤內(nèi)相關(guān)淋巴細胞判斷等尚缺乏統(tǒng)一標準。目前TILs在泌尿系腫瘤研究中多集中于TME、生存預后及免疫治療等方面，且大多數(shù)為回顧性分析，仍需要在大規(guī)模、多中心、隨機對照、前瞻性等實驗的基礎(chǔ)上進一步研究，從而發(fā)揮TILs在抗腫瘤免疫治療中的巨大潛能，擴大免疫治療在泌尿系腫瘤中的應用。