余孟英 王金蓮 陳 路 蒲勁松

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科，南充 637000)

骨肉瘤是最常見的主要發(fā)生于兒童和青少年的原發(fā)性骨惡性腫瘤，通常出現(xiàn)在長骨的末端，主要發(fā)生在膝蓋處[1]。該病屬于第八大癌癥，發(fā)病率高，且被診斷為骨肉瘤的兒童的5年生存率低于30%，10年生存率低于50%，嚴重威脅家庭和社會安定[2]。雖然近幾年骨肉瘤的治療策略取得了一些進展，但仍然存在預后差等問題?；蛩降闹委熞恢笔枪侨饬龅难芯繜狳c。已有研究表明miR-490-5p能夠抑制肝癌、膀胱癌、人肝內膽管癌等癌癥的發(fā)生和發(fā)展，但其對骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展的作用尚不清楚[3-5]。SP1屬于kruppel樣轉錄因子家族，是一種廣泛參與細胞凋亡、生長、代謝和分化的鋅指轉錄因子，在肺癌、結直腸癌和胃癌等癌癥中表達均升高，并導致多種致癌基因的表達，已有報道顯示SP1可促進骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展[6]。本文主要研究miR-490-5p對骨肉瘤細胞生長和運動的作用，以期為骨肉瘤的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系 正常成骨細胞株hFOB1.19和骨肉瘤細胞MG63購自美國ATCC細胞庫。

1.1.2試劑 RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，胎牛血清購自德國PAN公司，mimic-NC、miR-490-5p mimic、SP1質粒購自上海生物工程有限公司，Lipofectamine 2000購自美國 Invitrogen 公司，Dual Luciferase報告基因試劑盒購自美國 Promega 公司，BCA試劑盒購自北京天根生化有限公司。

1.1.3動物 24只裸鼠購自四川夏派森醫(yī)藥科技有限公司，許可證號：SYXK(川)2017-203。裸鼠在25℃，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)的飼養(yǎng)室，自由獲取水和食物。在實驗前1周開始適應性喂養(yǎng)。

1.1.4儀器 MD全自動顯微鏡購自美國Molec-ular Devices公司；超凈工作臺購自蘇州凈化設備廠。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組 人骨肉瘤MG63細胞在37℃、5%CO2條件下，培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。實驗設置control組、mimic-NC組、miR-490-5p mimic組、SP1組、mimic+SP1組。根據(jù)Lipofectamine 2000說明書將質粒分別或聯(lián)合轉染進入各組骨肉瘤MG63細胞。

1.2.2RT-qRCR檢測miR-490-5p和SP1的表達 將細胞收集后用TRIzol裂解液抽提總RNA并逆轉錄為cDNA，用GAPDH作為內參進行RT-qPCR檢測。本實驗所用引物序列：miR-490-5p F：5′-GCAAACAACCAUUCGGCUGUC-3′，R：5′-CGCAGGTCCGGAGTAGGT-3′;SP1 F:5′-TGGTGGGCAGTA-TGTTGT-3′，SP1 R:5′-GCTATTGGCATTGGTG-AA-3′;GAPDH F：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′，GAPDH R：5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTG-3′。

1.2.3靶基因預測運用基因預測軟件 TargetScan軟件(http://www.targetscan.org)預測miR-128-3p的靶基因。

1.2.4雙熒光素酶活性測定靶向關系 以海腎熒光素酶的熒光值作為內參，按照Dual Luciferase報告基因試劑盒說明書進行操作。

1.2.5MTT法檢測細胞增殖 將胰蛋白酶消化的MG63細胞懸浮液按2×103個/孔加入96孔板，待細胞生長至50%時，更換無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，加入血清，在不同時間加入MTT，再培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基加入DMSO，上機測定A570，代表細胞活力。

1.2.6Western blot檢測Ki67、PCNA、Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、E-cadherin和N-cadherin表達 用RIPA裂解液提取總蛋白，并用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，經 SDS-PAGE分離蛋白后，用半干轉膜儀轉移蛋白質至PVDF膜，并用脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，然后加入一抗在4℃封閉過夜，再加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴ECL曝光。

1.2.7Transwell檢測細胞侵襲將細胞 以無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶消化以3×105個/ml傳代接種于用Matrigel預處理的Transwell小室中，小室上層加入無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，下層則加入含血清的正常培養(yǎng)液，48 h后用無菌棉簽擦去小室上層細胞，下層細胞HE染色后計數(shù)。

1.2.8劃痕實驗檢測細胞遷移 將各組骨肉瘤MG63細胞消化鋪滿單層后用小號槍頭垂直劃痕，加入無血清培養(yǎng)基，5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，顯微鏡下拍照，Image J 軟件分析。

1.2.9裸鼠體內實驗 將裸鼠隨機分為Control組和miR-490-5p mimic組，每組 12只，雌雄各半。各組裸鼠右后肢腹側皮下注射 0.2 ml 1×107個/ml骨肉瘤MG63細胞和轉染miR-490-5p mimic的骨肉瘤MG63細胞懸液。SPF條件下正常飲食飼養(yǎng)，觀察裸鼠皮下成瘤情況。第 30 天頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下腫瘤，電子天平稱重，Western blot檢測Ki67、Bax、caspase-3、E-cadherin蛋白表達情況。

2 結果

2.1miR-490-5p在骨肉瘤細胞MG63中低表達 與正常hFoB1.19細胞相比，骨肉瘤細胞MG63中miR-490-5p的表達量明顯下調(P<0.01，圖1A)，說明miR-490-5p在骨肉瘤細胞MG63中低表達。

2.2miR-490-5p mimic上調骨肉瘤細胞MG63 miR-490-5p 的表達 RT-qPCR結果顯示，與Control組骨肉瘤MG63細胞中miR-490-5p的表達量相比，mimic-NC組差異無統(tǒng)計學意義，說明空載質粒對骨肉瘤MG63細胞中miR-490-5p表達無影響，而miR-490-5p mimic組miR-490-5p表達量明顯上調(P<0.01，圖1B)，說明miR-490-5p mimic質粒有效，能上調骨肉瘤細胞MG63 miR-490-5p表達。

圖1 RT-qRCR檢測miR-490-5p表達水平Fig.1 miR-490-5p mRNA expression level was detected by RT-qRCRNote:A.**.P<0.01 versus hFOB1.19 cells;B.**.P<0.01 versus control group.

2.3miR-490-5p靶向作用SP1 3′-UTR 通過基因預測軟件和Pubmed篩選出SP1作為 miR-490-5p的靶基因，miR-490-5p與SP1在3′UTR區(qū)存在結合位點(圖2A)。熒光素酶報告基因實驗結果表明，miR-490-5p對野生型SP1表達有明顯下調作用，對突變型無明顯作用，提示 miR-490-5p直接靶向作用于SP1(P<0.01，圖2C)。SP1的表達結果表明，與Control組相比，mimic-NC組細胞SP1表達水平無明顯變化，miR-490-5p mimic組SP1表達量顯著下調，SP1組SP1表達量顯著上調，說明空載質粒對細胞SP1表達無影響，miR-490-5p mimic對SP1具有抑制作用，pcDNA-SP1能使SP1過表達；mimic+SP1組SP1表達，與Control組和mimic-NC組比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組顯著上調，比SP1組顯著下調，說明 miR-490-5p和SP1具有靶向關系，并且過表達 miR-490-5p抑制SP1表達(P<0.01，圖2B、D)。

圖2 miR-490-5p靶向作用于SP1Fig.2 miR-490-5p targets to SP1Note:A.Target genes of miR-490-5p were screened by the gene prediction software TargetScan;B.Expression of SP1 was detected by RT-qRCR;C.Targeting relationship was detected by luciferase activity;D.Expression of SP1 was detected by Western blot;**.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus single transfection group.

2.4miR-490-5p過表達靶向SP1抑制骨肉瘤細胞MG63增殖 與Control組相比，mimic-NC組細胞生長速度無明顯變化，miR-490-5p mimic組細胞生長速度明顯下降，SP1組細胞生長速度明顯升高(P<0.01，圖3A)，說明空載質粒對細胞生長速度無影響，miR-490-5p mimic抑制細胞MG63增殖，pcDNA-SP1促進細胞MG63增殖；mimic+SP1組細胞MG63生長速度與Control組和mimic-NC組比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組明顯增多，比SP1組明顯下降，說明miR-490-5p過表達靶向SP1抑制骨肉瘤細胞MG63增殖(P<0.01，圖3A)。與Control組相比，mimic-NC組細胞Ki67和表PCNA表達量顯著下調，SP1組Ki67和PCNA表達量顯著上調，說明空載質粒對細胞Ki67和PCNA表達無影響，miR-490-5p 過表達抑制Ki67和PCNA表達，SP1過表達促進Ki67和PCNA1表達(P<0.01，圖3B)；mimic+SP1組Ki67和PCNA表達量，與Control組和mimic-NC組相比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組明顯上調，比SP1組明顯下調，說明miR-490-5p過表達靶向SP1抑制骨肉瘤細胞MG63增殖(P<0.01，圖3B)。

圖3 各組細胞增殖情況Fig.3 Cell proliferation in each groupNote:A.Cell proliferation was detected by MTT;B.Ki67 and PCNA protein expressions were detected by Western blot;**.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus single transfection group.

2.5miR-490-5p過表達靶向SP1促進骨肉瘤細胞MG63凋亡 與Control組相比，mimic-NC組細胞Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9表達水平無明顯變化，miR-490-5p mimic組Bcl-2表達量明顯下調，Bax、caspase-3和caspase-9明顯上調，SP1組Bcl-2表達量明顯上調，Bax、caspase-3和caspase-9明顯下調，提示空載質粒對細胞MG63凋亡無影響，miR-490-5p 過表達可能抑制細胞MG63凋亡，SP1過表達可能促進細胞MG63凋亡(P<0.01，圖4)；mimic+SP1組Bcl-2表達與Control組和mimic-NC組相比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組明顯上調，比SP1組明顯下調，mimic+SP1組Bax、caspase-3和caspase-9表達，與Control組和mimic-NC組相比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組明顯下調，比SP1組明顯上調，提示miR-490-5p過表達靶向SP1可能促進骨肉瘤細胞MG63凋亡(P<0.01，圖4)。

圖4 Western blot檢測Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9表達水平Fig.4 Detection of Bcl-2,Bax,caspase-3 and caspase-9 expression levels by Western blotNote:**.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus single transfection group.

2.6miR-490-5p過表達靶向SP1抑制骨肉瘤細胞MG63侵襲 與Control組相比，mimic-NC組侵襲細胞數(shù)目無明顯變化，miR-490-5p mimic組侵襲細胞數(shù)目顯著減少，SP1組侵襲細胞數(shù)目顯著增多，說明空載質粒對MG63細胞侵襲能力無影響，miR-490-5p 過表達對MG63細胞侵襲具有抑制作用，SP1過表達促進MG63細胞侵襲；mimic+SP1組侵襲細胞數(shù)目與Control組和mimic-NC組相比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組顯著增多，比SP1組顯著減少，說明miR-490-5p過表達靶向SP1抑制骨肉瘤細胞MG63侵襲(P<0.01，圖5)。

2.7miR-490-5p過表達靶向SP1抑制骨肉瘤細胞MG63遷移 與Control組相比，mimic-NC組劃痕寬度和愈合率無明顯變化，miR-490-5p mimic組劃痕顯著增寬、愈合率顯著降低，SP1組劃痕顯著變窄、愈合率顯著升高，說明空載質粒對MG63細胞遷移速度無影響，miR-490-5p 過表達對MG63細胞遷移速度具有抑制作用，SP1過表達促進MG63細胞遷移能力；mimic+SP1組侵襲愈合率與Control組和mimic-NC組相比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組顯著升高，比SP1組顯著降低，說明miR-490-5p過表達靶向SP1抑制骨肉瘤細胞MG63遷移(P<0.01，圖6)。

圖6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力(×400)Fig.6 Migration ability of each group was tested by scratch test(×400)Note:**.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus single transfection group.

2.8miR-490-5p過表達靶向SP1抑制骨肉瘤細胞MG63上皮間質轉化 與Control組相比，mimic-NC組E-cadherin和N-cadherin的表達無明顯變化，miR-490-5p mimic組E-cadherin表達顯著上調，N-cadherin表達顯著下調；SP1組E-cadherin表達顯著下調，N-cadherin表達顯著上調，說明空載質粒對MG63細胞上皮間質轉化無影響，miR-490-5p 過表達對MG63細胞上皮間質轉化具有抑制作用，SP1過表達促進MG63細胞上皮間質轉化；mimic+SP1組E-cadherin表達，與Control組和mimic-NC組比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組顯著下調，比SP1組顯著上調；mimic+SP1組N-cadherin表達，與Control組和mimic-NC組比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組顯著上調，比SP1組顯著下調，說明miR-490-5p過表達靶向SP1抑制骨肉瘤細胞MG63上皮間質轉化(P<0.01，圖7)。

圖7 Western blot檢測E-cadherin和N-cadherin的表達Fig.7 Expression levels of E-cadherin and N-cadherin were detected by Western blotNote:**.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus single transfection group.

2.9miR-490-5p過表達抑制骨肉瘤細胞MG63體內生長和運動 30 d后，與Control組相比，miR-490-5p mimic組腫瘤重量顯著減輕，說明miR-490-5p過表達抑制骨肉瘤細胞MG63的發(fā)生和發(fā)展(P<0.01，圖8A)。與Control組相比，miR-490-5p mimic組Ki67、Bax和caspase-3表達顯著下降，E-cadherin表達顯著升高，說明miR-490-5p過表達抑制骨肉瘤細胞MG63體內增殖和上皮間質化、誘導細胞凋亡(P<0.01，圖8B)。

圖8 裸鼠體內實驗結果Fig.8 Results of nude mouse in vivo experimentNote:A.Tumor weight statistics;B.Expression levels of Ki67，Bax，caspase-3 and E-cadherin were detected by Western blot.**.P<0.01 versus control group.

3 討論

miRNA在癌癥中異常表達，可作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用[7]。如miR-302a在人骨肉瘤細胞中低表達，并抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-490-5p在腎細胞癌中低表達，并通過靶向PIK3CA抑制腎細胞癌細胞生長[9]。本研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中miR-490-5p表達水平低于非癌組織，提示miR-490-5p可能作為腫瘤抑制因子參與骨肉瘤發(fā)病。

SP1 基因位于人染色體第 12q13.1 區(qū)域，由 788 個殘基組成，參與幾乎所有的細胞功能，包括細胞增殖、凋亡和分化[10]。SP1是一種促癌蛋白，在腫瘤組織中的表達顯著上調，且與腫瘤的浸潤程度呈正相關，而下調SP1能抑制癌細胞形成腫瘤[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-335通過靶向SP1調控人骨肉瘤細胞MG63的增殖[12]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-490-5p和SP1具有靶向關系，并與SP1在3′UTR區(qū)存在結合位點，并且miR-490-5p過表達抑制SP1表達，從而抑制骨肉瘤細胞MG63的生長和運動。

骨肉瘤作為常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展是多步驟、多階段、多因素共同參與的結果，而細胞過度增殖是其生理功能最突出的變化[13]。因此，有效抑制細胞增殖是骨肉瘤治療的關鍵。已有報道m(xù)iR-490-5p過表達能夠抑制肝癌細胞的增殖，因此，miR-490-5p過表達有望抑制骨肉瘤細胞的增殖[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-490-5p過表達靶向SP1抑制骨肉瘤細胞MG63的增殖。而腫瘤的發(fā)生不僅是因為細胞的增殖速度快，而且和細胞的凋亡速度息息相關。因此，干預細胞凋亡是骨肉瘤治療的關鍵。Xu等[15]報道m(xù)iR-490-5p過表達誘導肝癌細胞凋亡，因此，miR-490-5p過表達有望誘導骨肉瘤細胞凋亡。本研究證明miR-490-5p過表達靶向SP1誘導骨肉瘤細胞MG63凋亡。

骨肉瘤患者癥狀為短期疼痛和腫脹，剛發(fā)病時易被忽略，因此，一般就診時癥狀已經持續(xù)了較長時間[16]。而由于骨肉瘤具有高度侵襲性和遠處轉移的潛能，所以通常確診時約85%的骨肉瘤患者已經發(fā)生轉移[17]。骨肉瘤早期及術后易發(fā)生血源性轉移，最常見于肺，其次為其他身體組織和器官，這往往是造成癌癥患者死亡的主要原因[18]。因此，有效抑制細胞的侵襲和轉移速度是骨肉瘤治療的關鍵切入點之一。已有研究報道m(xù)iR-490-5p通過直接調控ROBO1抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，因此，miR-490-5p過表達有望抑制骨肉瘤細胞的侵襲和遷移[19]。本研究證明miR-490-5p過表達靶向SP1抑制骨肉瘤細胞MG63的侵襲和遷移。在轉移進展過程中，上皮間質轉化驅動原發(fā)性上皮樣腫瘤細胞獲得侵襲性間充質表型，活動性和侵襲性增強，最終通過直接的局部組織浸潤或通過血管和淋巴管發(fā)生轉移[20]。因此，骨肉瘤中控制上皮間質轉化是一種有效抑制細胞轉移和提高癌癥患者生存率的策略。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-490-5p過表達靶向SP1抑制骨肉瘤細胞MG63上皮間質轉化。

通過體外實驗可知，miR-490-5p過表達靶向SP1抑制骨肉瘤細胞MG63生長和運動。相比單一的外部環(huán)境，生物體內環(huán)境是極其復雜多變的，為了更好地了解miR-490-5p對骨肉瘤細胞生長和運動的影響，本研究進行了裸鼠體內實驗，發(fā)現(xiàn)miR-490-5p過表達可減輕小鼠骨肉瘤，抑制骨肉瘤細胞MG63體內增殖和上皮間質化、誘導細胞凋亡。

綜上所述，miR-490-5p靶向SP1對骨肉瘤細胞MG63生長和運動起調節(jié)作用，主要誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化。這說明miR-490-5p在骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，但其是否為骨肉瘤治療靶點還有待進一步研究。