吳黎黎 賈健安 邵璇璇 黃保軍

(安徽醫(yī)科大學(xué)免疫教研室,合肥 230001)

Graves病(GD)是一種常見的自身免疫性甲狀腺疾病，促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)結(jié)合于促甲狀腺激素受體(TSHR)，促進(jìn)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增生，分泌過量甲狀腺激素，引起甲狀腺腫大和甲亢[1]。TRAb檢測(cè)對(duì)于GD診斷及療效監(jiān)測(cè)具有重要意義[2-4]。TRAb含量極低，因此，其性質(zhì)及其與TSHR的作用機(jī)制研究困難極大，基因工程技術(shù)獲取重組單抗是解決這一問題的有效途徑[5]。單鏈抗體(ScFv)分子量小、穿透力強(qiáng)，是特異性和親和性最小的抗體功能片段，廣泛用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究、疾病體外診斷及疾病的臨床治療[6]。單鏈抗體與全抗體相比，ScFv穩(wěn)定性較差且功能單一，而Fc端蛋白不但維持ScFv抗體功能和穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，還可方便抗體純化。本研究構(gòu)建了含有TRAb單鏈抗體與IgG1Fc序列的重組載體pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc，運(yùn)用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)單鏈抗體融合蛋白的高效表達(dá)，并檢測(cè)目的蛋白免疫學(xué)活性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種及細(xì)胞 大腸桿菌DH10Bac、Sf9細(xì)胞株和High FiveTM細(xì)胞株均購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

1.1.2試劑 蛋白Marker、PureLinkTMHiPure質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、膠回收試劑盒等均購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；SIM SF和SIM HF培養(yǎng)基購(gòu)于北京義翹神州科技有限公司；dNTP購(gòu)于美國(guó)promega公司；DNA marker購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；TRAb 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑購(gòu)于羅氏公司；SPA-Sepharose CL-4B親和層析柱購(gòu)于美國(guó)GE公司；氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、瓊脂糖、瓊脂粉、酵母提取物、IPTG和Bluo-gal等均購(gòu)于Biosharp生物科技公司；即用型SABC-POD(人IgG)試劑盒購(gòu)于博士德生物公司。

1.2方法

1.2.1序列的合成和載體的構(gòu)建 查閱人源化TRAb抗體的HV和LV序列[7]。以linker(G4S)連接，并于HV的5′端加上GP67信號(hào)肽序列;Genbank檢索IgG1Fc段序列(AF150959),SnapGene軟件分析上述基因序列和載體pFastBacTM1,優(yōu)化并模擬構(gòu)建載體，交由上海捷瑞生物工程有限公司合成，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc(圖1A)。

1.2.2重組桿粒的生成 pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac，該細(xì)胞含有帶mini-attTn7靶位點(diǎn)的桿狀病毒穿梭載體(桿粒)和輔助質(zhì)粒。載體pFastBacTM1上的mini-Tn7元件與DH10Bac上的mini-attTn7靶位之間發(fā)生轉(zhuǎn)座反應(yīng)，將目的基因插入桿狀病毒基因組，生成重組桿粒(圖1B)。藍(lán)白斑篩選試驗(yàn)挑選陽性克??；PureLinkTMHiPure質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒分離純化重組桿粒DNA；pUC/M13正向和反向引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證和基因測(cè)序，引物序列為F:5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′。

圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建圖Fig.1 Construction map of recombinant plasmidNote:A.Construction map of pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc;B.Partial sequence of recombinant plasmid which will be into rod.

1.2.3桿狀病毒儲(chǔ)液的生成和擴(kuò)增 27℃、無CO2條件下，SIM SF專用培養(yǎng)基培養(yǎng)Sf9昆蟲細(xì)胞至對(duì)數(shù)期，且存活率大于95%，Cellfectin?Ⅱ試劑轉(zhuǎn)染；倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯、顆粒狀外觀或從培養(yǎng)板脫離時(shí)，收集上清(P1病毒儲(chǔ)液，滴度約為5×106pfu/ml)，繼續(xù)感染Sf9細(xì)胞，生成P2(滴度約為5×107pfu/ml)病毒儲(chǔ)液，繼續(xù)感染Sf9細(xì)胞，生成P3(滴度約為5×108pfu/ml)病毒儲(chǔ)液。

1.2.4單鏈重組抗體TRAb的表達(dá)和分析 27℃、無CO2條件下，SIM HF專用培養(yǎng)基培養(yǎng)High FiveTM細(xì)胞至生長(zhǎng)中期，密度為1×106個(gè)/ml時(shí)，用2 ml P3病毒儲(chǔ)液于500 ml搖瓶?jī)?nèi)感染High FiveTM細(xì)胞，共感染5瓶，依次標(biāo)記為1、2、3、4、5；24 h收集1號(hào)搖瓶培養(yǎng)上清100 ml，SPA-Sepharose CL-4B親和層析柱純化,48 h收集2號(hào)搖瓶培養(yǎng)上清100 ml，純化；72 h收集3號(hào)搖瓶，96 h收集4號(hào)搖瓶，120 h收集5號(hào)搖瓶,得到大量含有可溶性單鏈抗體ScFv-IgG1Fc的上清，SPA-Sepharose CL-4B親和層析柱純化；純化后的抗體分別用BCA試劑盒檢測(cè)其抗體表達(dá)。收集的72 h上清純化后行SDS-PAGE凝膠電泳分析純度，化學(xué)發(fā)光法和免疫組化檢測(cè)抗體活性。

1.2.5免疫組化檢測(cè)目的蛋白與甲狀腺組織TSHR結(jié)合力 目的蛋白作為一抗，其ScFv部分與人正常甲狀腺組織上的TSHR結(jié)合，生物素標(biāo)記的兔抗人IgG作為二抗與目的蛋白的IgG1 Fc段結(jié)合，SABC放大系統(tǒng)和DAB顯色系統(tǒng)于光學(xué)顯微鏡OlympusBX43下觀察。

2 結(jié)果

2.1重組桿粒的PCR鑒定 3 000 bp和5 000 bp約檢測(cè)出3 747 bp條帶，符合理論預(yù)測(cè)(2 300 bp+1 447 bp)，測(cè)序結(jié)果顯示目的基因構(gòu)建正確(圖2)。

圖2 重組桿粒的PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR identification of recombinant baculovirusNote:M.Trans2K plus DNA marker;1,2,3.PCR products which were amplified by forward and reverse primers.

2.2可溶性單鏈抗體融合蛋白BCA濃度檢測(cè)和SDS-PAGE的鑒定 隨培養(yǎng)時(shí)間的增加，目的蛋白表達(dá)增加(圖3A)。72 h表達(dá)與48 h表達(dá)差異顯著(P<0.01)，96 h表達(dá)與72 h表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明目的蛋白于72 h表達(dá)量最高，純化后的抗體濃度為1.746 mg/ml。72 h目的蛋白出現(xiàn)于55 kD附近，無雜帶，純度較高(圖3B)。

圖3 目的蛋白的BCA和SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)Fig.3 Detection of expressions of target protein by BCA and SDS-PAGENote:M.Protein marker;1.Purified antibody.

2.3單鏈抗體融合蛋白ScFv-IgG1Fc免疫活性檢測(cè) 目的蛋白的ScFv部分競(jìng)爭(zhēng)性抑制化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的TRAb與TSHR結(jié)合，導(dǎo)致光電信號(hào)減弱。目的抗體原滴度均大于檢測(cè)上限(40 U/L)，故稀釋20倍后檢測(cè)，相對(duì)熒光單位(RLU)和換算后的抗體活性濃度證實(shí)單鏈抗體融合蛋白與TSHR有較高的親和力(圖4)。

圖4 ECLIA檢測(cè)抗體活性濃度Fig.4 Antibody activity concentration detected by ECLIANote:Compared with Negative control,**.P<0.01.

2.4目的蛋白與TSHR結(jié)合力結(jié)果顯示甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞周圍呈現(xiàn)出棕黃色，提示目的蛋白與TSHR具有較高結(jié)合力(圖5)。

圖5 免疫組化檢測(cè)目的蛋白結(jié)合力(×400)Fig.5 Binding force of target protein detected by IHCT(×400)Note:A.PBS insteading of primary antibody as negative contrast;B.Positive expression of target protein insteading of primary antibody.

3 討論

TRAb在Graves病和甲狀腺相關(guān)性眼病(TAO)的發(fā)病中起重要作用，但具體機(jī)制尚不明確[8,9]。孕婦體內(nèi)高濃度的TRAb可穿過胎盤屏障影響胎兒發(fā)育[10]。因此，闡明TRAb結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制可為臨床診斷和治療提供依據(jù)。

單克隆抗體具有較高的靈敏度和特異性，廣泛用于疾病臨床診斷、治療、預(yù)防和蛋白質(zhì)提純。國(guó)外先后制備了鼠源性TRAb，但在人循環(huán)系統(tǒng)的半衰期較短，易被人免疫系統(tǒng)識(shí)別，多次使用易產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)[11，12]。Sanders等[13]于2003年獲得了目前應(yīng)用最廣泛的人源性刺激性的TRAb抗體(M22)。Smith等[14]于2004年報(bào)道以M22-生物素為基礎(chǔ)的檢測(cè)TRAb的ELISA技術(shù)，具有較高靈敏度和特異性。羅氏公司開發(fā)了以M22為主要反應(yīng)試劑的檢測(cè)TRAb的電化學(xué)發(fā)光免疫分析法,簡(jiǎn)便快捷，臨床應(yīng)用較為廣泛。Sanders等[13]獲得的人源性單克隆抗體由EB病毒淋巴永生化標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離和克隆分泌性雜交瘤技術(shù)制成，但傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)制備周期較長(zhǎng)、成本較高、所獲得細(xì)胞不穩(wěn)定。單鏈抗體作為小型改造抗體保留了抗原的親和活性，分子量小、副作用低，旦生產(chǎn)成本低、易于規(guī)?；a(chǎn)，應(yīng)用前景廣泛。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了人源化的TRAb單鏈抗體融合蛋白的高效表達(dá)，比同源重組桿粒表達(dá)縮短了2周。在構(gòu)建重組載體的基礎(chǔ)上，運(yùn)用SnapGene軟件對(duì)質(zhì)粒載體pFastBacTM1、帶有GP67信號(hào)肽的ScFv序列、IgG1Fc段序列進(jìn)行分析、優(yōu)化和模擬重組質(zhì)粒的構(gòu)建，以基因合成的方式構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc。G4S linker是剛性結(jié)構(gòu)重復(fù)出現(xiàn)的4個(gè)甘氨酸和1個(gè)絲氨酸組成的15肽序列，可拉緊VH和VL，且不影響VH、VL的自由折疊和分子動(dòng)力學(xué)的改變；GP67信號(hào)肽幫助剪輯成熟的目的蛋白穿膜分泌至胞外。本實(shí)驗(yàn)獲得的抗體蛋白為人源化單鏈抗體融合蛋白，具有較高抗原親和力。人源化抗體具有更加優(yōu)越的臨床療效和最低的免疫原性[15]。報(bào)道表明TRAb屬于異質(zhì)性抗體，分為刺激性抗體(TSAb)、阻斷性抗體(TBAb)和中性抗體[16]。TSAb與TSHR結(jié)合后，刺激甲狀腺細(xì)胞的增殖和激素的分泌，誘發(fā)甲狀腺功能亢進(jìn)；TBAb與TSHR結(jié)合后，阻斷TSH與TSHR的結(jié)合，誘發(fā)甲狀腺功能減退，而TSAb在Graves病中占主導(dǎo)地位。因此，本實(shí)驗(yàn)室選擇性表達(dá)TSAb，可用于Graves病的診斷和療效觀察，或用于TRAb與TSHR結(jié)合的生物學(xué)研究，為自身免疫性甲狀腺疾病的免疫治療奠定基礎(chǔ)。