肖忠盛 龍 泓 丁成明 肖友忠 劉麗兵

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，衡陽(yáng) 421001)

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，具有發(fā)病隱匿、預(yù)后較差的特點(diǎn)，對(duì)患者的生命健康造成嚴(yán)重威脅[1]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesen-chymal transition,EMT)是生物體內(nèi)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的一種生物學(xué)過(guò)程，已證實(shí)與多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[2]。除EMT外，惡性腫瘤非可控的血管新生能力同樣是影響腫瘤生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素[3]。胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ mRNA結(jié)合蛋白3(insulin-like growth factor Ⅱ mRNA binding protein 3,IMP3)是人體內(nèi)高度保守的mRNA結(jié)合蛋白[4]。既往研究證實(shí)其在乳腺癌、胃癌等多種腫瘤的進(jìn)展中扮演重要角色[5,6]。但對(duì)于其具體機(jī)制及是否通過(guò)Notch信號(hào)通路等下游通路影響腫瘤尚未完全明確。Notch信號(hào)通路是一種能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞增殖、凋亡及周期調(diào)控等造成重要影響的通路，高表達(dá)的Notch通常促進(jìn)胃癌及結(jié)腸癌等腫瘤的形成[7]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討IMP3是否通過(guò)Notch信號(hào)通路影響結(jié)直腸癌的EMT以及血管生成，以期為結(jié)直腸癌的治療進(jìn)一步提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑及設(shè)備 IMP3 shRNA序列及陰性對(duì)照序列由華大基因合成；lipofectamin 2000試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾；Notch通路抑制劑BMS-708163購(gòu)自MedChemExpress有限公司； RIPA裂解液和BCA試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；Western blot中抗體均購(gòu)自Abcam；MTT試劑盒購(gòu)自Sigma-Aldrich；Transwell小室和Matrigel膠購(gòu)自上海前塵生物科技有限公司；光學(xué)顯微鏡和酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自Molecular Device。

1.1.2研究對(duì)象 收集2017年1月～2018年2月于我院確診的73例結(jié)直腸癌患者腫瘤切除術(shù)后的新鮮結(jié)直腸癌組織及癌旁組織(距病灶5 cm)?；颊吣挲g36～82歲，平均 (59.11±6.60) 歲。依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟2010年標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者進(jìn)行TNM分期[8]：Ⅰ期33例、Ⅱ期40例。受試者均遵照以下納排標(biāo)準(zhǔn)[9]：經(jīng)過(guò)臨床、影像、病例確診的結(jié)直腸癌瘤；診斷時(shí)未發(fā)生轉(zhuǎn)移；經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)診療程序；所有病例術(shù)前均未經(jīng)放療、化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性病灶；未按照規(guī)范程序診療；其他惡性腫瘤病史。所有瘤組織及癌旁組織樣本均切成小塊后迅速置于凍存管中以液氮保存。本研究經(jīng)我院臨床實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)同意，所有患者簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1免疫組化半定量檢測(cè)癌癥及癌旁組織中IMP3蛋白表達(dá) 10%的甲醛固定組織，烤片，脫蠟，梯度酒精脫水。用pH=6.0的檸檬酸鈉微波修復(fù)，加熱沸騰20 min，自然冷卻，PBS洗滌5 min×3次。3%的H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶15 min，PBS沖洗后擦干，滴加5% BSA封閉液并于37℃孵育30 min。滴加人IMP3一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS溶液洗滌5 min×3次。滴加生物素化的二抗山羊抗兔IgG于37℃孵育30 min后PBS沖洗5 min×3次。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次。DAB/H2O2反應(yīng)染色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明后封片。觀察IMP3陽(yáng)性表達(dá)的定位及IMP3陽(yáng)性表達(dá)百分比，陰性細(xì)胞核為藍(lán)色或淺藍(lán)色，陽(yáng)性細(xì)胞漿為棕黃色或強(qiáng)棕黃色，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野 (400×)，每個(gè)視野數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分[10]。

1.2.2細(xì)胞分組及處理 將購(gòu)買(mǎi)的結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板80%～90%時(shí)，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。將SW620細(xì)胞分為空白組(不作任何處理)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染含IMP3 shRNA陰性對(duì)照序列的脂質(zhì)體+lipofectamin 2000)、IMP3 shRNA組(轉(zhuǎn)染含IMP3 shRNA序列脂質(zhì)體+lipofectamin 2000)、通路抑制劑組(Notch通路抑制劑BMS-708163處理)、聯(lián)合組(IMP3 shRNA聯(lián)合BMS-708163共同處理)。

1.2.3Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞EMT和血管生成相關(guān)因子表達(dá) RIPA裂解液溶于PMSF使其終濃度為1 mmol/L，取250 μl裂解液至離心管中裂解各組SW620細(xì)胞5 min后于4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清，稀釋后以BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜并用含5%BSA的TBST在脫色搖床上室溫封閉1 h。棄封閉液，加入一抗Notch1、Hes1、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、VEGF、TNF-α或TGF-β，4℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗10 min×3次。加入HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的二抗IgG于室溫?fù)u床孵育2 h。TBST漂洗5 min×3次，ECL顯色，X片曝光，照相。使用E-Gel Imagergel documentation system分析顯色條帶吸光度。以樣本的平均吸光度除以相應(yīng)內(nèi)參照的平均吸光度即為樣本蛋白的相對(duì)含量，將各樣本蛋白的相對(duì)含量間做統(tǒng)計(jì)分析圖。

1.2.4四唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)各組細(xì)胞活力 SW620細(xì)胞處理48 h后，0.25%胰酶消化30 s，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔接種到96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h。隨后每個(gè)培養(yǎng)孔中加入MTT溶液20 μl(5 mg/ml)放于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，棄上清。每孔中加入DMSO 150 μl，震蕩使結(jié)晶溶解并混勻。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔吸光值，以空白培養(yǎng)基調(diào)零，取各組平行孔的平均OD值，繪制各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.2.5Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力 用預(yù)冷的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基以1∶10 稀釋Matrigel后，各上室加入100 μl，室溫放置2 h；將上述各組處理48 h 的SW620細(xì)胞消化后用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)并稀釋至3×105個(gè)/ml，取100 μl 加入Transwell上室，下室中加入600 μl含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，按照Transwell小室說(shuō)明書(shū)操作，用結(jié)晶紫染色，光鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野并計(jì)數(shù)跨膜的細(xì)胞數(shù)并計(jì)算細(xì)胞侵襲率。侵襲率=穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1IMP3在癌組織中高表達(dá) 免疫組化結(jié)果表明，IMP3在組織各處都有表達(dá)。與癌旁組織 (38.7%) 相比，癌組織 (78.4%) 中IMP3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 IMP3蛋白在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)(×200)

2.2IMP3沉默介導(dǎo)Notch通路抑制SW620細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 Western blot結(jié)果表明，相較于陰性對(duì)照組，IMP3 shRNA組、通路抑制劑組和聯(lián)合組中Notch1及Hes1表達(dá)顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合組抑制效果更明顯，與IMP3shRNA組、通路抑制劑組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與陰性對(duì)照組相比，IMP3 shRNA組、通路抑制劑組和聯(lián)合組N-cadherin和Vimentin蛋白水平顯著降低，但E-cadherin在上述組中表達(dá)顯著升高(P<0.05)。聯(lián)合組N-cadherin和Vimentin指標(biāo)變化更明顯，與shRNA組和抑制劑組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。空白組與陰性對(duì)照組各指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞Vimentin、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)情況Fig.2 Vimentin,E-cadherin and N-cadherin protein expression in each groupNote:A.Expression of Vimentin,E-cadherin and N-cadherin was determined by western blot.B.Quantification of protein expression.Compared with Negative control group,#.P<0.05;compared with combined treatment group,*.P<0.05.

2.3IMP3沉默介導(dǎo)Notch通路抑制SW620細(xì)胞血管生成相關(guān)因子表達(dá) 與陰性對(duì)照組相比，IMP3 shRNA組、通路抑制劑組和聯(lián)合組VEGF、TNF-α和TGF-β蛋白水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白組上述三種因子表達(dá)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。聯(lián)合組效果對(duì)上述蛋白的抑制效果更明顯，與shRNA組和抑制劑組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 各組細(xì)胞VEGF、TNF-α和TGF-β蛋白表達(dá)情況Fig.3 VEGF,TNF-α and TGF-β protein expression in each groupNote:A.Expression of VEGF,TNF-α and TGF-β was determined by western blot.B.Quantification of protein expression.Compared with Negative control group,#.P<0.05;compared with combined treatment group,*.P<0.05.

2.4IMP3沉默介導(dǎo)Notch通路抑制SW620細(xì)胞活力 與陰性對(duì)照組相比，IMP3 shRNA組、通路抑制劑組和聯(lián)合組細(xì)胞活力在24 h、48 h及72 h均顯著降低(P<0.05)；空白組在上述時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。聯(lián)合組細(xì)胞活力降低更為明顯，與shRNA組和通路抑制劑組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 MTT檢測(cè)各組細(xì)胞活力

2.5IMP3沉默介導(dǎo)Notch通路減弱SW620細(xì)胞侵襲能力 與陰性對(duì)照組相比，IMP3 shRNA組、通路抑制劑組和聯(lián)合組穿膠細(xì)胞數(shù)均顯著增多(P<0.05)；空白組無(wú)顯著差異(P>0.05)。聯(lián)合組細(xì)胞侵襲受到更顯著的抑制，與shRNA組和通路抑制劑組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 Transwell法檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力(×400)

3 討論

越來(lái)越多的研究證實(shí)，多種惡性腫瘤中均可見(jiàn)EMT的發(fā)生，出現(xiàn)EMT的患者對(duì)放化療不敏感，對(duì)分子靶向藥物的耐藥性也逐漸增強(qiáng)，EMT則是患者對(duì)此類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥的關(guān)鍵因素之一[11]。非可控的血管新生能力作為惡性腫瘤的重要特征，也是引起腫瘤生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素[12]。本研究從結(jié)直腸癌EMT及血管生成的分子調(diào)控機(jī)制出發(fā)，證實(shí)了IMP3基因介導(dǎo)Notch信號(hào)通路在結(jié)直腸癌中的調(diào)控機(jī)制。

本研究對(duì)切除的結(jié)直腸癌組織和癌旁組織行HE染色發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于癌旁組織，結(jié)直腸癌腺體組織結(jié)構(gòu)紊亂，且血管生成和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。IMP3基因是胰島素樣生長(zhǎng)因子mRNA結(jié)合蛋白家族(IMPs)的 成員之一，Riener等[13]在研究中發(fā)現(xiàn)，IMP3在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)顯著增強(qiáng)，且其表達(dá)程度與癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等存在關(guān)聯(lián)。Wei等[14]也發(fā)現(xiàn)，IMP3表達(dá)增強(qiáng)可能是結(jié)腸癌進(jìn)展過(guò)程中的早期事件，也是促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的重要原因。本研究通過(guò)免疫組化檢測(cè)IMP3在結(jié)直腸癌和癌旁組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IMP3在癌組織(78.4%)中表達(dá)顯著高于其在癌旁組織(38.7%)中表達(dá)。進(jìn)一步證實(shí)了IMP3在結(jié)直腸癌進(jìn)展中扮演重要角色。

Notch信號(hào)通路廣泛存在于生物體內(nèi)，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡、分化等起重要的調(diào)控作用[15]。Notch信號(hào)通路與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，越來(lái)越多的研究證實(shí)結(jié)直腸癌患者體內(nèi)Notch信號(hào)通路被顯著激活[16]。Hes1是Notch的靶基因，同時(shí)也是腫瘤干細(xì)胞的重要標(biāo)記物。在腫瘤組織中，Hes1高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖，而阻斷其表達(dá)則會(huì)加速誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡和分化[17]。Notch1作為Notch通路的主要受體，在細(xì)胞的增殖凋亡調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Notch1高表達(dá)可加速未分化細(xì)胞的惡化，在結(jié)直腸癌進(jìn)展中發(fā)揮促癌作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，Notch1以及Hes1在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)顯著增強(qiáng)，沉默IMP3基因后，其表達(dá)被抑制，提示IMP3基因沉默在抑制Notch信號(hào)通路表達(dá)中發(fā)揮重要作用。腫瘤在進(jìn)展過(guò)程中，其細(xì)胞能夠與周?chē)g質(zhì)相互作用，上皮細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，具體表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)的減弱以及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin和N-cadherin表達(dá)的增強(qiáng)，這種現(xiàn)象也被稱(chēng)為EMT，是導(dǎo)致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于陰性對(duì)照組，IMP3 shRNA組及Notch通路抑制組的Vimentin和N-cadherin表達(dá)降低，而E-cadherin表達(dá)升高，聯(lián)合組變化更明顯，進(jìn)一步提示了IMP3基因沉默能夠抑制Notch信號(hào)通路進(jìn)而抑制SW620細(xì)胞EMT的發(fā)生。血管生成是腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲以及疾病進(jìn)展的重要因素。TNF-α作為人體內(nèi)關(guān)鍵促炎因子，能夠激活多種血管生成相關(guān)因子進(jìn)而引起缺血、腫瘤血管生成增加[20]。VEGF和TGF-β是常見(jiàn)的促血管生成因子，與多種腫瘤的血管生成有關(guān)，同時(shí)也可作為癌癥浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的重要評(píng)估指標(biāo)[21]。本研究測(cè)量處理后細(xì)胞的血管生成相關(guān)因子發(fā)現(xiàn)，IMP3基因沉默或抑制Notch信號(hào)通路能夠抑制TNF-α、VEGF和TGF-β的表達(dá)，且聯(lián)合組抑制程度更明顯，提示IMP3基因沉默介導(dǎo)Notch信號(hào)通路在抑制結(jié)直腸癌血管生成中具有重要作用。MTT以及Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)各組細(xì)胞活力及細(xì)胞侵襲能力，發(fā)現(xiàn)IMP3沉默或抑制Notch通路表達(dá)后，SW620細(xì)胞的細(xì)胞活力及侵襲率均顯著降低，且聯(lián)合組更明顯，進(jìn)一步說(shuō)明了IMP3基因沉默能夠介導(dǎo)Notch信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)SW620細(xì)胞活力和侵襲能力的抑制作用。

綜上所述，IMP3基因沉默能夠抑制Notch通路活化進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌EMT及血管生成，在結(jié)直腸癌的進(jìn)展中具有保護(hù)作用。IMP3以及Notch通路聯(lián)合處理能夠在結(jié)直腸癌的治療中發(fā)揮更好的效果。對(duì)于IMP3介導(dǎo)Notch通路是否受上游miRNA的調(diào)控仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。