李向峰 陳文霞

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 450000)

肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)主要由肺炎支原體引起，通常表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與感染引起的上皮細(xì)胞凋亡和機(jī)體對(duì)肺炎支原體感染產(chǎn)生過度免疫應(yīng)答有關(guān)，主要包括免疫細(xì)胞激活和細(xì)胞炎癥因子分泌[1-3]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6和干擾素-γ(IFN-γ)作為引起炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞因子，與MMP的發(fā)生密切相關(guān)[4-6]。魚腥草總黃酮為中藥魚腥草的有效成分，具有抑菌作用，對(duì)肺炎有一定療效，但魚腥草總黃酮用于MPP鮮有報(bào)道[7-8]。本研究觀察魚腥草總黃酮對(duì)MMP治療治療鮮鼠肺組織病理的影響，檢測(cè)肺組織Bcl-2和Bax蛋白與mRNA表達(dá)水平，及血清炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-γ水平，探討魚腥草總黃酮對(duì)MPP的抗感染作用及其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠50只，4周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK(豫)2015-0064。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲水和攝食。

1.1.2試劑 MP標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-15531購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，魚腥草總黃酮(1∶10)購(gòu)自鄭州康吉元生物科技有限公司，支原體肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，Bcl-2和Bax引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，TNF-α、IL-6和IFN-γ ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與給藥 50只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、魚腥草總黃酮低、中和高劑量組，每組10只。模型組、魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠建立MP感染模型，乙醚麻醉，鼻腔內(nèi)接種30 μl MP菌液(1×107ccu/L)，1次/d，連續(xù)3 d。每組隨機(jī)挑選2只小鼠摘眼球取血，靜置15 min，3 000 r/min離心10 min，取上清，嚴(yán)格按照MP核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行支原體檢測(cè)，陽(yáng)性為造模成功[9]。魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠灌胃給予劑量為0.5、1.0、2.0 g/kg的魚腥草總黃酮，1次/d，連續(xù)7 d。對(duì)照組和模型組小鼠給予等體積生理鹽水。

1.2.2標(biāo)本采集 末次給藥后禁食不禁水12 h，稱取體質(zhì)量，摘眼球取血，靜置15 min，3 000 r/min離心10 min，取上清，-80℃?zhèn)溆?。分離小鼠左右兩側(cè)肺組織，稱取肺濕重，計(jì)算肺濕重指數(shù)：肺濕重指數(shù)=肺質(zhì)量/體質(zhì)量×100%，-80℃保存。

1.2.3HE染色觀察肺組織病理變化 取小鼠肺組織，10%甲醛固定48 h，洗滌，置于不同濃度的乙醇中梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切4 μm厚片，脫蠟，HE染色，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4Western blot檢測(cè)肺組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá) 取肺組織提取總蛋白，BCA法蛋白定量。取25 μl蛋白行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Bcl-2和Bax一抗，4℃過夜，加入二抗(1∶5 000)，孵育1 h，化學(xué)發(fā)光發(fā)顯色。以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行蛋白條帶定量分析，計(jì)算灰度值。

1.2.5RT-PCR檢測(cè)肺組織Bcl-2和Bax mRNA表達(dá) 取小鼠肺組織制備細(xì)胞懸液，Trizol提取總RNA測(cè)定純度，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，1.4%瓊脂糖分別加入Bcl-2和Bax引物進(jìn)行電泳，凝膠成像儀掃描定量，以目的基因與β-actin的產(chǎn)物電泳帶OD值比值作為目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。Bcl-2 F：5′-GACTTCGCCGAGATGTCCAG-3′；R：5′-CGGTGCTTGGCAATTAGTGG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度482 bp；Bax F：5′-ATGGAGCTGCAGAGGATT-3′；R：5′-AATGTCCAGCCCATGATGGTTC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度202 bp；β-actin F：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′；R：5′-CTCCTTAATTGTCACGCACAGTTC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度540 bp。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)后72℃再延伸5 min。

1.2.6ELISA法檢測(cè)血清炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-γ水平 取小鼠血清，ELISA法檢測(cè)血清炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-γ水平，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠肺濕重指數(shù)比較 與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺濕重指數(shù)明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠肺濕重指數(shù)明顯降低(P<0.05)，魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠肺濕重指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠肺濕重指數(shù)

2.2各組小鼠肺組織病理情況 肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡內(nèi)無(wú)滲出。模型組小鼠肺組織出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎，肺泡腔變窄，肺泡間質(zhì)可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠肺組織炎癥浸潤(rùn)明顯減輕，且呈劑量依賴性。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining of lung tissues of mice in each group(×200)Note:A.Control group;B.Model group;C.Low dose group;D.Medium dose group;E.High dose group.

2.3各組小鼠肺組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠肺組織Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值明顯升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見圖2。

2.4各組小鼠肺組織中Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織中Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Bax mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠肺組織Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，Bax mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值明顯升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見圖3。

圖3 各組小鼠肺組織Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of Bcl-2 and Bax mRNA in lung tissues of mice in each groupNote:A.Control group;B.Model group;C.Low dose group;D.Medium dose group;E.High dose group.Compared with control group，*.P<0.05;compared with model group,#.P<0.05.

2.5各組小鼠血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平 與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平明顯降低(P<0.05)，與魚腥草總黃酮低劑量組相比，魚腥草總黃酮中和高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平明顯降低(P<0.05)，與魚腥草總黃酮中劑量組相比，魚腥草總黃酮高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見表2。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平比較

3 討論

MPP的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與毒素感染、上皮細(xì)胞黏附和免疫功能受損相關(guān)[10-12]。因此，臨床對(duì)MPP的機(jī)理研究主要集中于抗感染、上皮細(xì)胞調(diào)控和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等方面。Bcl-2家族通過與其他凋亡蛋白協(xié)同作用調(diào)控線粒體結(jié)構(gòu)與功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[13]?？沟蛲龅鞍譈cl-2和促凋亡蛋白Bax為Bcl-2家族成員，二者協(xié)同作用調(diào)控機(jī)體細(xì)胞凋亡。研究表明，Bcl-2過表達(dá)可保護(hù)細(xì)胞抵抗外界因素導(dǎo)致的凋亡，相反，當(dāng)Bax過表達(dá)時(shí)，觸發(fā)Bax自我激活的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞膜通透性增加，促發(fā)細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax比值大小對(duì)細(xì)胞受外界因素刺激后發(fā)生凋亡起關(guān)鍵作用[14，15]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織Bcl蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯降低，Bax蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2/Bax比值明顯降低，說(shuō)明MP感染小鼠肺組織后，促進(jìn)Bax表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

MP感染導(dǎo)致機(jī)體免疫紊亂，發(fā)生炎癥浸潤(rùn)，促使TNF-α、IL-6和IFN-γ等細(xì)胞炎癥因子釋放。TNF-α作為早期細(xì)胞炎癥因子，促使中性粒細(xì)胞釋放，誘導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)[16]。IL-6參與炎癥反應(yīng)整個(gè)過程，是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)過程中起重要作用[17]。李容漢等[18]研究發(fā)現(xiàn)，MP感染后血清TNF-α和IL-6水平與感染程度呈正相關(guān)，其水平可準(zhǔn)確反映患者病情。IFN-γ具有抗病毒、激活體液免疫的功能，主要由T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，其水平變化可反映MPP嚴(yán)重程度[19]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平明顯升高，說(shuō)明MP感染激活機(jī)體免疫應(yīng)答，促發(fā)炎癥反應(yīng)。

MPP在中醫(yī)范疇屬于“肺風(fēng)咳嗽”，病因?yàn)榱鶗r(shí)邪、正氣虧虛，臨床以清熱解毒止咳平喘為治則[20]。魚腥草具有清熱解毒、化痰消癰等功效，歸肺經(jīng)、大腸經(jīng)和膀胱經(jīng)，是治療“肺癰”的要藥，主要有效成分為黃酮類。研究表明，魚腥草總黃酮具有抗氧化，抗病毒、抑菌、抗炎、提高免疫力等藥理作用[21，23]。本研究結(jié)果表明，與模型組相比，魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠肺組織Bcl-2表達(dá)水平明顯升高，Bax蛋白與mRNA表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2/Bax比值明顯升高，說(shuō)明不同劑量的魚腥草總黃酮均可上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Bax激活，阻止Bax作用于線粒體外膜，使Bcl-2/Bax比值升高，有效抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，魚腥草總黃酮可減輕肺損傷，對(duì)MMP感染小鼠起抗感染作用，其作用機(jī)制可能與上調(diào)肺組織Bcl-2表達(dá)、下調(diào)Bax表達(dá)、降低血清炎癥因子水平有關(guān)。