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        子宮內(nèi)膜漿液性癌通過免疫組化和原位雜交檢測(cè)HER2/neu蛋白過表達(dá)與基因擴(kuò)增的對(duì)照及可行性研究*

        2020-09-29 08:41:28張建筑袁士成彭曉峰趙文麗易智君劉鏡文秦文華侯衛(wèi)華
        黑龍江醫(yī)藥 2020年9期
        關(guān)鍵詞:免疫組化異質(zhì)性指南

        張建筑,袁士成,彭曉峰,趙文麗,易智君,劉鏡文,楊 紅,秦文華,侯衛(wèi)華

        1.惠州市第一人民醫(yī)院病理科,廣東 惠州 516000;2.惠州市中心人民醫(yī)院病理科,廣東 惠州 516000;3.惠州市第一婦幼保健院病理科,廣東 惠州 516000;4.平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院病理科,河南 平頂山 467000;5.解放軍第989醫(yī)院病理科,河南 平頂山 467000

        子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)中較常見的腫瘤,ESC約占所有子宮內(nèi)膜癌的8.7%~10.2%。ESC惡性程度高,對(duì)常規(guī)化療藥物易出現(xiàn)耐藥,治療效果差,復(fù)發(fā)率高。約50%病例確診時(shí)已伴有子宮外病變,此部分病例中,約30%~50%未發(fā)現(xiàn)明確的子宮肌層浸潤[1]。在精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代,為降低ESC患者的復(fù)發(fā)及死亡率,有必要對(duì)可能存在的靶向治療的靶點(diǎn)HER2/neu進(jìn)行研究。在乳腺癌和胃癌中,人表皮生長因子受體2(HER2/Neu,C-ERBB2)HER2蛋白過表達(dá)和(或)擴(kuò)增病例,其評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和應(yīng)用靶向藥物曲妥珠單抗治療的規(guī)范化流程和治療效果已得到確認(rèn)[2-4]。針對(duì)HER2表達(dá)的異質(zhì)性研究,反映這些腫瘤的獨(dú)特的生物特征和預(yù)測(cè)對(duì)HER2靶向治療的臨床效果[5-8]也取得了一些成果。雖然HER2/neu的子宮內(nèi)膜癌的研究已經(jīng)近20年,但并沒有形成完整的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和指南,以致在子宮內(nèi)膜癌中抗HER2藥物的應(yīng)用沒有準(zhǔn)確的HER2/neu擴(kuò)增狀態(tài)的依據(jù),研究得到的結(jié)果受到質(zhì)疑[9-16]。如有研究HER2過表達(dá)或HER2擴(kuò)增均與無進(jìn)展生存期或總生存期無關(guān)[17];還有部分研究提示,曲妥珠單抗作為單一藥物并未顯示出對(duì)具有HER2過表達(dá)或HER2擴(kuò)增的子宮內(nèi)膜癌的活性。在所有此類研究中,HER2過表達(dá)和(或)基因擴(kuò)增的病例所占各自研究病例的14%~80%,從這些結(jié)論中可以肯定的推斷,至少有部分研究在對(duì)HER2過表達(dá)和(或)基因擴(kuò)增的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和解讀是存在錯(cuò)誤的[9-15]。所以,對(duì)HER2/neu基因狀態(tài)的準(zhǔn)確評(píng)估非常重要,將嚴(yán)格篩選的HER2/neu蛋白過表達(dá)和/或基因擴(kuò)增病例入組抗HER2藥物治療,所得到的療效結(jié)果才是準(zhǔn)確可靠的[18]。近年來,有研究顯示,二代抗HER2/neu藥物如達(dá)可替尼、阿法替尼等對(duì)化療耐藥的HER2/neu基因擴(kuò)增的ESC顯著有效[19-20];絡(luò)氨酸酶抑制劑與抗HER2藥物的聯(lián)合應(yīng)用以及卡鉑-紫杉醇聯(lián)合曲妥珠單抗在治療ESC的研究也取得了很大的進(jìn)展[21-24]。因此,有必要對(duì)新型抗HER2/neu藥物在對(duì)化療耐藥的HER2/neu基因擴(kuò)增ESC患者中臨床應(yīng)用進(jìn)行研究?;谝陨锨闆r,我們采用ASCO/CAP2013版乳腺癌HER2檢測(cè)指南評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),對(duì)ESC病例HER2過表達(dá)和(或)基因擴(kuò)增情況進(jìn)行了研究。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        選取2010年1月—2018年5月間71例惠州市第一人民醫(yī)院及四家友好醫(yī)院(惠州市中心人民醫(yī)院、惠州市婦幼保健院、平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院、解放軍第989醫(yī)院)初發(fā)ESC手術(shù)切除標(biāo)本蠟塊,所有患者術(shù)前均未做放、化療,病人年齡50~82歲。免疫組化:一抗為上?;蚬就每谷薍ER2,SP3單克隆抗體;其它所需配套試劑來自Leica(德國)公司;全自動(dòng)免疫組化儀為Leica BOND-Ⅲ,來自Leica(德國)公司。FISH檢測(cè)所用HER2-DNA探針試劑盒為Histra HER2 FISH Kit試劑盒,購自日本常光公司。免疫組化及FISH操作步驟均嚴(yán)格參照儀器使用流程和試劑使用說明。

        1.2 方法

        (1)所選用標(biāo)本蠟塊均為嚴(yán)格按照FISH及IHC固定要求(離體時(shí)間小于30 min,充分剖開,組織體積10倍左右4%中性甲醛固定6-48 h)。(2)常規(guī)石蠟切片,HE染色、IHC切片厚度均為4μm。(3)IHC染色采用乳腺癌評(píng)分HER2(3+)和HER2(0)做為陽性、陰性對(duì)照,染色評(píng)價(jià)后,按照ASCO/CAP 2013版乳腺癌HER2檢測(cè)指南評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀,按評(píng)分分為4組(3+組、2+組、1+組、0組),選取每個(gè)蠟塊IHC表達(dá)最強(qiáng)部分直徑0.4 cm組織,組內(nèi)優(yōu)先原則,每4塊組織同乳腺癌陽性、陰性(FISH實(shí)驗(yàn)證實(shí))對(duì)照制作一個(gè)組織芯片,組內(nèi)不足4塊則由其他組補(bǔ)入,最終制作組織芯片18個(gè),供FISH實(shí)驗(yàn)使用。(4)組織芯片F(xiàn)ISH切片厚度為4μm。

        1.3 結(jié)果判定

        參照ASCO/CAP2013版乳腺癌HER2檢測(cè)指南[25]的判定標(biāo)準(zhǔn):(1)免疫組化化學(xué)。HER2蛋白表達(dá)陽性HER2(3+):≥10%腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)而完整的膜陽性;HER2蛋白表達(dá)不確定HER2(2+):≤10%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)強(qiáng)而完整的膜陽性和/或>10%細(xì)胞出現(xiàn)不完整的弱至中等強(qiáng)度的細(xì)胞膜染色;HER2蛋白表達(dá)陰性HER2(1+)、HER2(0):>10%的浸潤性癌細(xì)胞呈現(xiàn)不完整的、微弱的細(xì)胞膜染色判度為HER2(1+);腫瘤完全陰性或≤10%細(xì)胞出現(xiàn)不完整、微弱的細(xì)胞膜染色判讀為HER2(0)。【注:在本次研究中,將IHC中強(qiáng)的U型著色(基底膜和側(cè)膜著色)判定等同于完整的膜陽性;將染色強(qiáng)度(5個(gè)級(jí)別:無信號(hào)、微弱表達(dá)、弱表達(dá)、中等輕度表達(dá)、強(qiáng)表達(dá))差異至少占腫瘤5%的比例定義為免疫組化染色異質(zhì)性】。(2)FISH HER2/neu基因擴(kuò)增:HER2/CEP17≥2.0和/或HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞數(shù)≥6,若HER2/neu信號(hào)連成簇,則不用計(jì)算比值,直接判定為HER2/neu基因擴(kuò)增;HER2/neu基因未擴(kuò)增:HER2/CEP17<2.0且HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞數(shù)<4;HER2/neu基因擴(kuò)增不確定:HER2/CEP17<2.0且6>HER拷貝數(shù)/細(xì)胞數(shù)≥4。FISH/HER2蛋白符合率:HER2/neu擴(kuò)增數(shù)+HER2/neu基因未擴(kuò)增數(shù)/HER2(3+)+HER2(1+)+HER2(0);HER2/neu基因擴(kuò)增率:HER2/neu基因擴(kuò)增數(shù)/病例總數(shù)。(注:本次HER2/neu的免疫組化結(jié)果和FISH結(jié)果均由兩名有資質(zhì)醫(yī)師單獨(dú)閱片,最后兩人得出的結(jié)果進(jìn)行參照、對(duì)比,不一致病例進(jìn)行討論、重新評(píng)估,最終得出結(jié)果)。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 HER2IHC評(píng)分分布及HER2/neu FISH結(jié)果的對(duì)照

        所有71例病例均進(jìn)行免疫組化HER2蛋白和FISH基因擴(kuò)增檢測(cè)。根據(jù)ASCO/CAP 2013版乳腺癌HER2檢測(cè)指南進(jìn)行評(píng)分,其中HER2(3+)18例;HER2(2+)17例;HER2(1+)26例;HER2(0)10例;其中有24例病例出現(xiàn)IHC表達(dá)的異質(zhì)性。應(yīng)用FISH實(shí)驗(yàn)檢測(cè):HER2(3+)病例中有16例HER2/neu基因擴(kuò)增, 1例未擴(kuò)增,1例HER2/neu基因擴(kuò)增不確定;HER2(2+)病例中,4例HER2/neu基因擴(kuò)增,11例HER2/neu基因未擴(kuò)增,2例HER2/neu基因擴(kuò)增不確定;HER2(1+)病例中,1例HER2/neu基因擴(kuò)增,25例HER2/neu基因未擴(kuò)增;HER2(0)病例中,HER2/neu基因擴(kuò)增病例數(shù)為0。除去HER2(2+)不確定病例,F(xiàn)ISH/HER2免疫組化符合率為94.4%(51/54),HER2基因擴(kuò)增率為29.5%(21/71),見表1,圖1。通過FISH檢測(cè)我們還發(fā)現(xiàn),有45.1%(32/71)的病例顯示17號(hào)染色體多體(HER2/CEP17>2.5)。

        表1 HER2IHC評(píng)分分布及HER2/neu FISH結(jié)果的對(duì)照 例

        2.2 HER2IHC異質(zhì)性與基因擴(kuò)增對(duì)照

        在IHC評(píng)分中,有24例病例出現(xiàn)了ICH表達(dá)的異質(zhì)性,其中有11例(52.4%,11/21)HER2/neu基因擴(kuò)增病,HER2/neu未擴(kuò)增及不確定病例中IHC表達(dá)異質(zhì)性所占比例為(26%,13/50),二者間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.065),見表2,圖1。

        表2 HER2IHC異質(zhì)性與基因擴(kuò)增對(duì)照 例(%)

        圖1 子宮內(nèi)膜漿液性癌的HER2免疫組化表達(dá)和HER2/neu基因擴(kuò)增

        3 討論

        本次研究得出了三個(gè)結(jié)論:(1)ESC中應(yīng)用ASCO/CAP 2013版乳腺癌HER2檢測(cè)指南進(jìn)行判讀,F(xiàn)ISH基因擴(kuò)增檢測(cè)和IHC免疫組化過表達(dá)情況有高度的一致性94.4%(51/54);(2)在ESC中,有29.5%的病例出現(xiàn)HER2/neu基因擴(kuò)增;(3)在ESC中,HER2蛋白的IHC表達(dá)存在較高的異質(zhì)性33.8%(24/71)。

        正確評(píng)估靶向藥物靶點(diǎn)的狀態(tài)對(duì)入組靶向藥物治療起決定性作用。乳腺癌和胃癌的HER2檢測(cè)指南已經(jīng)完備并隨著研究進(jìn)展不斷更新,ASCO/CAP在2018年對(duì)乳腺癌HER2檢測(cè)指南進(jìn)行了更新[26],根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)的更新,中國乳腺癌專家組制定了《乳腺癌HER2檢測(cè)指南(2019版)》[27]。目前國內(nèi)外尚無針對(duì)ESC的HER2檢測(cè)指南及抗HER2靶向藥物的應(yīng)用規(guī)范。漿液性子宮內(nèi)膜癌是子宮內(nèi)膜癌最具生物學(xué)攻擊性的變體,具有較高的復(fù)發(fā)率和對(duì)常規(guī)化療的相對(duì)耐藥性,這對(duì)腫瘤科醫(yī)生提出了重大的治療挑戰(zhàn)[28-30]。在以往子宮內(nèi)膜漿液性癌HER2研究中,缺乏規(guī)范的HER2檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)來顯示HER2/neu的基因狀態(tài),導(dǎo)致研究中HER2過表達(dá)率在14%~80%[8-12,31-36],這種不規(guī)范性主要體現(xiàn)在,部分研究沒有將Ⅰ型、Ⅱ型子宮內(nèi)膜樣癌分開研究,甚至有人將惡性苗勒氏混合瘤也納入研究組中[8-16]。雖然部分研究是依照ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測(cè)指南或FDA(食品藥品管理局)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)IHC結(jié)果進(jìn)行判讀,但有的將HER2蛋白評(píng)分(2+)和(3+)的病例完全納入HER2/neu基因擴(kuò)增病例,對(duì)HER2狀態(tài)的評(píng)估的不規(guī)范,導(dǎo)致最后應(yīng)用抗HER2靶向藥物的療效產(chǎn)生不同的結(jié)果。近年來一些研究顯示,應(yīng)用新型抗HER2/neu基因的靶向藥物或聯(lián)合應(yīng)用絡(luò)氨酸激酶抑制劑等其它藥物,會(huì)使HER2/neu基因擴(kuò)增的ESC病人受益[21-24]。

        本研究是基于ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測(cè)指南對(duì)ESC的HER2/nue的IHC蛋白表達(dá)和FISH基因擴(kuò)增進(jìn)行的,研究顯示,ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測(cè)指南應(yīng)用于評(píng)價(jià)ESC的HER2/neu基因擴(kuò)增情況時(shí),除去IHC判讀HER2(2+)病例,IHC和FISH符合率為94.4%(51/54),有較高的符合率,說明ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測(cè)指南在檢測(cè)ESC的HER2/neu基因狀態(tài)是適用的。

        HER2/neu的IHC表達(dá)和基因擴(kuò)增特征在不同組織來源和組織學(xué)類型會(huì)有差異。在乳腺癌中,同一腫瘤中HER2/neu的IHC表達(dá)和(或)基因擴(kuò)增的一致性比較高,出現(xiàn)表達(dá)和(或)擴(kuò)增的異質(zhì)性比較少見[37-38];但是在胃癌中,許多病例HER2/neu的IHC表達(dá)和(或)基因擴(kuò)增狀態(tài)在同一腫瘤內(nèi)的不同區(qū)域會(huì)顯示出明顯的異質(zhì)性[39]。針對(duì)IHC蛋白表達(dá)的異質(zhì)性,在胃癌的活檢標(biāo)本中對(duì)于HER2/nue表達(dá)評(píng)價(jià)有專門的指導(dǎo)意見,在活檢標(biāo)本中,只要存在成簇的至少5個(gè)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)強(qiáng)的細(xì)胞膜著色,即可判定為HER2(3+)[8]。在我們的研究中,ESC的HER2/nue蛋白表達(dá)與胃癌相似,較多病例表現(xiàn)出了明顯的異質(zhì)性,僅在HER2/neu基因擴(kuò)增的病例中,就有52.4%(11/21)。我們得到的數(shù)據(jù),可以對(duì)子宮內(nèi)膜診刮標(biāo)本中HER2/neu的HER2/neu的免疫組化表達(dá)評(píng)價(jià)提供類似胃癌的建議。由于ESC中的IHC蛋白表達(dá)存在比例較高的異質(zhì)性,所以我們建議:對(duì)于ESC的HER2/neu的蛋白過表達(dá)和(或)基因擴(kuò)增狀態(tài)的評(píng)估應(yīng)采取大切片或多切片。

        在胃癌病例中,會(huì)出現(xiàn)HER2/neu蛋白IHC表達(dá)只在基底膜和側(cè)膜著色,而頂膜不著色,出現(xiàn)“U”形染色。在子宮內(nèi)膜漿液性癌中,也出現(xiàn)類似胃癌中的“U”形染色模式,尤其是在分化較好的、具有明確的腺管樣結(jié)構(gòu)的腫瘤或腫瘤區(qū)域。我們的研究發(fā)現(xiàn),根據(jù)ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測(cè)指南,把“U”型染色等同于完整膜染色,HER2(3+)的病例經(jīng)FISH檢測(cè)HER/neu均擴(kuò)增。證明根據(jù)“U”形染色陽性強(qiáng)度和比例來對(duì)HER2/neu的IHC進(jìn)行評(píng)分是可行的。

        綜上所述,在ESC中,評(píng)價(jià)HER2/neu的IHC過表達(dá)和/或基因擴(kuò)增情況,應(yīng)用ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測(cè)指南進(jìn)行判讀,IHC和FISH結(jié)果取得了較高的一致性,說明ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測(cè)指南是可以應(yīng)用于ESC的HER2/neu的過表達(dá)和(或)基因擴(kuò)增評(píng)估的;HER2/neu蛋白的IHC表達(dá),存在在同一ESC腫瘤中較大比例的異質(zhì)性,因此建議腫瘤應(yīng)大切片、多取材;“U”型染色在ESC中,在ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測(cè)指南評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)下,可等同完整的膜染色。隨著對(duì)HER2/neu的研究,針對(duì)HER2/neu基因擴(kuò)增的ESC病例的治療管理模式需要轉(zhuǎn)變[40]。本次研究僅進(jìn)行了HER2/neu免疫組化染色和FISH結(jié)果的對(duì)比及ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測(cè)指南在ESC中使用的可行性的研究,HER2/neu蛋白過表達(dá)和(或)基因擴(kuò)增病例應(yīng)用抗HER2藥物后治療效果的評(píng)價(jià)還有待于進(jìn)一步研究。

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