鄧智鋒 許昱 向榮 朱霆

(武漢大學人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 武漢 430060)

變應性鼻炎 (allergic rhinitis , AR)是一種常見的鼻黏膜慢性非感染性炎癥性疾病,主要表現(xiàn)為鼻癢、打噴嚏、流清涕、鼻塞，頻發(fā)的癥狀嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。目前AR的發(fā)病機制尚不明確，可能與鼻黏膜的免疫缺陷有關(guān)。多聚免疫球蛋白受體(polymeric immunoglobulin receptor, pIgR)作為免疫球蛋白超家族中經(jīng)典的一員，可特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)運多聚免疫球蛋白A(pIgA)和多聚免疫球蛋白M(pIgM)，在先天性免疫應答和適應性免疫應答中起關(guān)鍵作用[2-3]。目前針對pIgR與AR關(guān)系的研究鮮有報道，本研究觀察pIgR和IgA在AR患者鼻黏膜的表達，并初步探討pIgR在AR發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2016年1月～2017年5月在我科行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的患者22例，其中AR患者(AR組)12例，男性7例、女性5例；年齡21～42歲，平均(31.3±2.5)歲。單純鼻中隔偏曲患者(對照組)10例，男性6例、女性4例；年齡20～45歲，平均(32.7±2.8)歲。診斷標準依據(jù)2015年天津AR診斷和治療指南[4]。所有患者皮膚點刺試驗結(jié)果顯示粉塵螨++及以上。術(shù)中收集的鼻黏膜組織一部分置于4%的甲醛溶液固定后用于免疫組織化學分析，另一部分鼻黏膜組織置于液氮中保存用于實時聚合酶鏈反應(real time PCR, RT-PCR)分析。該實驗方案獲得我院倫理委員會審核并通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學分析 參考SP超敏試劑盒(購 自 北 京 中 杉 金 橋 生 物 技 術(shù) 有 限 公 司)說明書進行操作。將石蠟切片，脫蠟至水洗，室溫下在3%過氧化氫甲醇溶液中孵育20 min；然后采用乙二胺四乙酸(EDTA)修復液(pH=9.0)進行修復，時間約20 min；滴加一抗1∶50 (兔抗人pIgR多克隆抗體和兔抗人IgA多克隆抗體，均購于美國Abcam公司)，4 ℃冰箱過夜。依次滴加二抗及顯色液，沖洗后蘇木素復染、脫水、透明、中性樹膠封片，置于顯微鏡下采集圖片。 為測定pIgR和IgA 在AR組和對照組鼻黏膜細胞的表達水平，隨機選取5個視野(200倍)，用軟件對照片進行分析，將發(fā)現(xiàn)棕褐色顆粒的細胞定為陽性細胞，測出陽性染色面積占整張圖片面積的百分比。

1.3 RT-PCR 應用 Trizol法抽提組織和細胞中的總 RNA，用 PCR Master Mix (美國Fermentas公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板進行PCR擴增。pIgR上游引物5′TGCTGACCTCCAAGTGCTAA3′，下游引物5′TCACCACACTGAATGAGCCA3′;IgA 上 游 引 物5′AC-TTCCAATGCCCGCACAAT3′，下游引物5′CAGGACTG-CTGGTATGACTC3′;內(nèi)參照β-actin上游引物5′AGCG-AGCATCCCCCAAAGTT3′，下游引物5′GGGCACGAA-GGCTCATCATT3′(中 國 金 斯 瑞 生 物 科 技 有 限 公 司)，PCR反應條件均為:95 ℃預變性15 s，94 ℃變性30 s，60 ℃ 1 min ，共40個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。最后取10 mL反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，采集照片并進行掃描。每組均設(shè)置3個復孔，β-actin為參照，分析pIgR 及IgA mRNA的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 pIgR 和IgA在鼻黏膜的表達部位 鼻黏膜的免疫組織化學結(jié)果顯示，pIgR 主要表達在鼻黏膜的上皮細胞及腺細胞，基底細胞及杯狀細胞無表達；IgA主要表達在鼻黏膜的上皮細胞及固有層。

圖1 pIgR在AR組和對照組中的表達(SP×200) A. AR組；B. 對照組

圖2 IgA 在AR組和對照組中的表達(SP×200) A. AR組；B.對照組

2.2 pIgR 和IgA的RT-PCR分析 下鼻甲鼻黏膜pIgR mRNA表達水平在AR組明顯低于對照組， IgA mRNA表達水平在AR組明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組下鼻甲鼻黏膜中pIgR 和IgA mRNA表達水平的比較

2.3 pIgR和IgA免疫組織化學染色及結(jié)果判定 AR組鼻黏膜pIgR的陽性表達明顯低于對照組，AR組鼻黏膜IgA陽性表達明顯高于對照組，2組表達差異均有統(tǒng)計學意義 (P值均<0.05)。見表2。

表2 2組下鼻甲鼻黏膜中pIgR 和IgA蛋白表達水平的比較

3 討論

pIgR是一種細胞跨膜蛋白受體，在先天性免疫應答和適應性免疫應答中起關(guān)鍵作用[5-6]。pIgR主要由上皮細胞和腺體產(chǎn)生，可以將IgA從黏膜固有層轉(zhuǎn)運至黏膜表面，同時其胞外段被蛋白水解酶裂解，形成分泌型免疫球蛋白(secretory IgA，sIgA),后者包括分泌成分(secretory component，SC)即pIgR的胞外段和IgA[7]。SC具有高度的穩(wěn)定性，其多糖側(cè)鏈可以封閉IgA最易被蛋白酶降解的鉸鏈區(qū);另外，分泌物中的SC可以使黏液更加黏稠，并且SC的糖基黏附于黏膜上皮，使SIgA在黏膜表面整齊排列，增加了上皮細胞表面黏液的黏附作用和防御能力。IgA是黏膜組織中的主要球蛋白，由漿細胞產(chǎn)生，在黏膜上皮主要以SIgA的形式存在，能夠發(fā)揮多種保護作用，如黏附或中和病原體、免疫排除功能、調(diào)理作用等[2,8-9]。

在維持鼻黏膜機體穩(wěn)態(tài)中，被轉(zhuǎn)運至黏膜表面的sIgA可以與病原體結(jié)合，阻止病原體在黏膜表面的吸附，從而阻止病原體進入或破壞上皮細胞[8,10]。SC可以在黏膜表面與某些細菌成分相結(jié)合，減少感染發(fā)生率；SC還可以直接參與對機體的保護，能夠發(fā)揮清除微生物的作用，發(fā)揮非特異性免疫保護功能[11-12]。SC可以降低細菌毒素對上皮細胞的損害，還可以阻止sIgA的降解，發(fā)揮保護sIgA的作用，提高黏膜的免疫功能[2,8,13]。

有研究[14-15]報道，pIgR在黏膜上皮的不同部位發(fā)揮防御功能。但在一定情況下微生物可以利用pIgR介導的穿胞轉(zhuǎn)運作用為自己服務(wù)，即微生物通過pIgR介導侵入黏膜上皮屏障。在哺乳動物中，pIgR的表達上調(diào)能夠促進sIgA的分泌，但pIgR的調(diào)節(jié)機制尚不明確，其表達和功能受多種因素的影響，如病原相關(guān)分子模式、促炎因子、激素等[16-17]。如細胞因子干擾素-γ(interferon γ, IFN-γ)刺激人腸上皮細胞系(HT-29細胞)，發(fā)現(xiàn)IFN-γ的劑量與pIgR的濃度呈一定的劑量依賴關(guān)系；研究[19]發(fā)現(xiàn)，微生物及其代謝產(chǎn)物如脂多糖、丁酸鹽、雙鏈RNA及呼吸道病毒都可以上調(diào)人腸上皮黏膜pIgR的表達，丁酸鹽能夠上調(diào)HT-29細胞pIgR的表達[11,18]。我們早前的研究發(fā)現(xiàn)pIgR的表達還與嗜酸性粒細胞及Th17細胞轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。

黃麗等[20]發(fā)現(xiàn)，干燥綜合征患者唾液腺上皮細胞中pIgR mRNA表達水平和pIgR表達水平均明顯低于對照組，可能是誘發(fā)干燥綜合征的重要機制之一。本研究發(fā)現(xiàn)，pIgR主要表達在鼻黏膜的上皮層和固有層腺體，IgA主要表達在鼻黏膜的固有層；與對照組比較，AR患者鼻黏膜組織中IgA的表達增多，pIgR的表達下降，差異有統(tǒng)計學意義。鑒于此，我們推測AR鼻黏膜組織中pIgR的表達下降，使IgA的轉(zhuǎn)運受阻，導致IgA堆積，這種黏膜的免疫缺陷可能與AR的發(fā)生密切相關(guān)。

綜上所述，我們證實了pIgR在AR鼻黏膜中的表達下調(diào) ，提示pIgR介導的天然免疫在鼻黏膜防御作用下降可能是AR的一個重要發(fā)生機制。我們將進一步探究pIgR在AR鼻黏膜中表達的調(diào)控途徑，為AR的治療提供新思路。