張道微 張圣海

(復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031)

上世紀70代初，科學家曾假設外源性的DNA基因治療可能是一種有效的治療遺傳性疾病的方法。這種方法在理論上可以通過一次治療獲得持久的臨床療效。盡管從提出概念到臨床應用的過程是漫長而曲折，但基因治療已經(jīng)給越來越多的醫(yī)學領域帶來新的治療選擇。我們總結(jié)了視網(wǎng)膜相關疾病基因治療的現(xiàn)狀，重點關注幾種常見疾病的研究內(nèi)容，并概述了這些新型治療方法的前景和局限性，以便相關研究人員參考。

1 視網(wǎng)膜疾病的基因治療進展

幾十年來基因治療因其良好前景受到各領域的關注，相關研究者都希望借此幫助解決治療效果有限的問題，但由于潛在風險、臨床轉(zhuǎn)化困難等原因，一直難以取得突破性進展。直至2017年,第1例基因治療生物制劑CTL019獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)批準，用于治療復發(fā)或難治性B細胞急性淋巴細胞白血病[1]。

基因治療能夠挽救或維持視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能，有望通過保留和提高患者視力進而改善其生活質(zhì)量。正在進行的已注冊臨床研究中針對視網(wǎng)膜疾病基因治療的有76項，其中43項正處于研究階段或已在招募患者，19項已經(jīng)完成，3項正處于注冊階段。43項正在進行的項目中有3項獲得了部分安全性和有效性等結(jié)果，并已公開發(fā)表?，F(xiàn)階段進行干預的研究占比75%，其余多為對已干預患者的長期隨訪研究，研究范圍主要覆蓋10種視網(wǎng)膜相關的疾病(表1)，臨床一期研究占到全部的一半左右，其余則處于2期或3期階段。在這些研究中，有37項受試者包含兒童，其中2項僅針對兒童進行。雖然已有研究表明基因治療中使用載體可能具有包括炎癥、全身反應等潛在危害，但病毒載體尤其是腺相關病毒載體仍是目前基因治療的主要工具。和其他疾病一樣，視網(wǎng)膜疾病的基因治療也主要是通過病毒載體將正?；?、cDNA或其他生物制劑導入視網(wǎng)膜下或玻璃體腔等部位。

2 常見視網(wǎng)膜疾病的基因治療研究現(xiàn)狀

眼所處的位置和解剖學特點使之在基因治療研究領域優(yōu)于深部器官，研究者易于操作并能夠?qū)ρ鄄堪Y狀和療效獲得直觀評價，并能避免各種原因?qū)ζ渌M織器官產(chǎn)生的影響。除此之外，由于視網(wǎng)膜下間隙是免疫赦免部位[2]，視網(wǎng)膜及其周圍微環(huán)境對免疫反應的局部抑制使外周強制表達視網(wǎng)膜抗原性時發(fā)生免疫抑制和抗自身免疫[3]，使免疫反應減弱或不發(fā)生。加之成熟可靠的操作技術、多樣化的檢查手段，使眼成為基因治療研究的理想器官。這里我們選取幾種前景良好的視網(wǎng)膜疾病進行討論，基因治療將為這些疾病的患者帶來新希望。

2.1 Leber先天性黑矇(Leber’s congenital amaurosis，LCA) 2017年Spark Therapeutics公司制造的針對RPE65突變相關LCA的產(chǎn)品Luxturna獲得FDA批準，成為第1批基因治療生物制劑，標志著基因治療時代的到來[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)至少存在25個基因突變位點可能造成LCA[5]，臨床最常見的類型為編碼RPE65視黃醛視覺循環(huán)關鍵酶的基因發(fā)生突變，兩組同期臨床實驗研究表明在視網(wǎng)膜下注射攜帶RPE65互補DNA的重組腺相關病毒，受試者的視敏感度、光敏感度、色覺、光譜敏感度等指標至少在3年內(nèi)得到顯著改善，并在1年時達到高峰。治療效果與維持視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的完整性有關，而與年齡無關[6-8]。平行動物實驗表明了不同物種間的差異性，人類基因治療還無法維持長期穩(wěn)定的狀態(tài)[7]。在1項1期隨訪試驗中，通過多種測量手段敘述了該項基因增強療法的綜合效益，研究雙側(cè)和對側(cè)眼基因治療的效果，首次確定了對側(cè)眼重復治療的效果和安全性[9]。另外，有研究[10-11]通過fMRI監(jiān)測證明受試者在基因治療后由于視網(wǎng)膜功能的恢復，傳入信息引起視皮質(zhì)的響應和激活在最多3年內(nèi)維持改善，并作為獨立評估基因治療效果和持久性的補充方法。3期臨床試驗目前已獲批的生物藥品 Luxturna用于治療RPE65相關的LCA，患者需每年行雙側(cè)視網(wǎng)膜下注射治療[12]。

表1 已注冊的視網(wǎng)膜疾病基因治療

CEP290相關LCA是兒童失明常見的遺傳類型，這種剪接突變經(jīng)反寡義核苷酸(antisense oligonucleotides，AONs)的治療能得到非常顯著的效果，通過直接或以病毒載體的方式都能使其轉(zhuǎn)錄被糾正[13]。在常見的CEP290突變[14]中使用剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸繞過突變隱蔽外顯子，使異常成纖維細胞恢復其纖毛，證明其異常剪接位點可以被糾正[14]。通過斷裂內(nèi)含肽治療鼠模型，成功通過反式剪接合成完整的CEP290蛋白，能得到顯著效果[15]。超過88%的GUCY2D突變會導致特殊的LCA，其編碼的鳥苷酸環(huán)化酶是光轉(zhuǎn)導途徑的關鍵酶，功能障礙時主要損傷視錐細胞，視桿細胞得以保留[16]。將人GUCY2D用于治療鼠模型，6個月內(nèi)保存視錐細胞效果良好，有望用于基因治療的臨床研究[17]。另一種早發(fā)型LCA致病基因LCA5的突變導致Lebercilin蛋白功能障礙，嚴重影響光感受器外段運輸。將人LCA5 cDNA注射到LCA5無效小鼠模型中進行基因增強治療，至少能夠部分挽救視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和視功能[18]。CRB1相關的LCA目前缺乏有效治療，研究仍處在臨床治療前期[19]。

2.2 視網(wǎng)膜色素變性(Retinitis pigmentosa, RP) RP是光感受器變性引起視黃酸受體(retinoic acid receptor, RAR)水平增高的致盲性疾病，因此有研究者[20]通過增強RAR的信號轉(zhuǎn)導途徑的方式建立小鼠模型，并以基因治療方式阻斷視黃酸信號通路，從而挽救RP。編碼環(huán)核苷酸門控通道β 1(cyclic nucleotide-gated channel β 1, CNGB1)的基因突變導致常染色體隱性RP, CNGB1-X26小鼠和CNGB1 -/-犬模型與人類RP45有相似的表型[21]，研究者[22]分別通過構(gòu)建鼠視紫紅質(zhì)啟動子調(diào)控CNGB1α的基因治療和人G蛋白偶聯(lián)受體激酶1啟動子調(diào)控cCNGB1對2種模型進行基因增強治療，并通過晚期視網(wǎng)膜成像等測量方法證明了其效果[23]。另一種方式是借助基因編輯技術，在Rho -/-，Rd10和RHO-P347S 3種鼠模型上以CRISPR/Cas9靶向破壞有絲分裂后期視桿細胞的Nrl基因，通過延長正常甚至是功能障礙或形態(tài)異常視桿細胞的存活時間，間接提高視紫紅質(zhì)基因突變RP的視錐細胞存活能力[24]。與之類似的是滅活Nrl基因下游與之起到協(xié)同作用的轉(zhuǎn)錄因子Nr2e3，同樣能使視桿細胞獲得部分視錐細胞的特性，研究者[25]在Rd10和FVB/N 2種不同RP模型上進行了AAV-gRNA/Cas9治療，結(jié)果顯示該基因組編輯方法能有效地將視桿細胞重編程為視錐細胞，進而有效保留光感受器，對于以視桿細胞丟失繼發(fā)視錐細胞喪失為特點的RP而言，這種治療方式具有良好的前景。同源獨立的靶向整合是基于CRISPR-Cas技術的一項新方法，大鼠模型證明了視網(wǎng)膜下注射對RP的治療作用[26]，這對基礎技術研究和基因治療都作出了貢獻。由于RP致病基因的異質(zhì)性通常使基因治療受到限制，而非特異性的基因治療能對挽救不同亞型的RP作出貢獻，靶向抑制Sirt6能將視桿細胞重編程，以增強其糖酵解來延緩RP發(fā)展[27]，將基因治療用于代謝和抗氧化途徑能普遍緩解神經(jīng)退行性疾病帶來的危害。目前RP還沒有統(tǒng)一的標準治療方案，但已有部分臨床試驗正在開展。

2.3 X-連鎖視網(wǎng)膜劈裂(X-linked retinoschisis, XLRS) XLRS是由視網(wǎng)膜各層質(zhì)膜蛋白結(jié)合相關的視網(wǎng)膜劈裂[28]基因突變導致的疾病。RS1-KO鼠模型已證明基因增強治療對光感受器喪失、視網(wǎng)膜損傷和囊腫形成都有積極作用，突觸的結(jié)構(gòu)和功能都得到了顯著恢復[29]。但在一項前瞻性臨床研究[30]中，9名受試者接受了單次單側(cè)玻璃體腔內(nèi)治療，病毒載體的免疫原性隨劑量升高，其安全性和耐受性不理想。近期有研究者[31]建立了轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應核酸酶攜帶致病突變(RS1，p.Y65X)的小鼠模型RS1-KI，以期對個體化基因組編輯治療提供幫助。另有以固體脂質(zhì)納米顆粒結(jié)合右旋糖苷或透明質(zhì)酸構(gòu)建載體，有效通過承載鼠視蛋白驅(qū)動子mPOS控制人RS1基因?qū)κ竽Ｐ瓦M行治療，發(fā)現(xiàn)有助于鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)改善[32]。

2.4 色盲 色盲主要由視錐細胞編碼環(huán)核苷酸門控[33]離子通道亞基A3(α亞基)或B3(β亞基)的基因突變導致，其他罕見病因包括GNAT2，PDE6C和PDE6H突變。在CNGA3(-/-)/Nrl(-/-)的鼠模型研究中，證明基因治療能有效改善視錐細胞功能，同時由于病變主要發(fā)生在黃斑中心凹，玻璃體注射還避免了潛在的視網(wǎng)膜損傷[34]，提示玻璃體內(nèi)注射的方式有望應用于人類黃斑中心凹疾病的安全基因治療。但另一項基因增強治療研究中，將紅/綠視蛋白啟動子用于控制CNGA3基因，經(jīng)視網(wǎng)膜下注射治療綿羊，其效果已維持3年以上且沒有明顯副作用[35]。多個機構(gòu)從2015年起開始招募受試者進行CNGA3或CNGB3 1期試驗，目前這2種主要突變都在臨床研究過程中[36]。另外，有研究者[37]發(fā)現(xiàn)視錐細胞PDE6α'對其配體PDE6γ'的親和力高于對視桿細胞PDE6γ的親和力，PDE6γ'還有利于組裝并形成穩(wěn)定的PDE6全酶，這在研究PDE6α'相關色盲的基因治療時有重要意義。

2.5 Stargardt病(Stargardt disease, STGD) 最主要的STGD為隱性Stargardt黃斑變性(STGD1)，是由編碼ATP結(jié)合盒亞家族A成員4(ATP binding cassette subfamily A member 4 , ABCA4)轉(zhuǎn)運蛋白的基因突變引起。目前STGD還不具備標準的臨床治療方法，相關研究人員在1年時間內(nèi)對27名受試者進行了3次視網(wǎng)膜下治療，并計劃隨訪15年以評估其長期安全性和療效[37]。為提高STGD治療的有效性，各種研究機構(gòu)正在開展相關的臨床前實驗，以求得到更好的治療方案。有研究者[38]嘗試通過基因治療來增加小鼠中最重要的負性調(diào)節(jié)蛋白CRRY從而挽救STGD1，基因治療對疾病導致的脂褐素累積和光感受器變性有效，并對同類病因引起的視網(wǎng)膜疾病有提示作用。為建立更良好的疾病模型，對ABCA4基因進行移碼插入(c.4176insC)，可獲得純合ABC4蛋白功能喪失的犬，或有助于建立STGD1的大型動物模型[39]。除此之外，針對ABC4大基因優(yōu)化的雙AAV雜合ABCA4載體，能有效增加基因?qū)氲挠行訹40]。最新對于大基因的研究通過遺傳元件斷裂內(nèi)含肽將多個AAV載體運送的多肽片段拼接為完整的蛋白，進而在鼠模型上實現(xiàn)STGD1的高效治療[15]。

3 基因治療的前景和局限

長期以來遺傳性視網(wǎng)膜疾病通過傳統(tǒng)藥物和手術治療無法取得顯著效果，且存在難治愈、治療手段少、預后差等問題。新興的基因治療將重點放在糾正或替代致病基因帶來的異常改變上，通過載體穩(wěn)定導入足量治療基因或通過基因組編輯技術進行基因置換、基因沉默、基因增強、基因修復等方式來減輕突變基因的危害，有效、安全、經(jīng)濟地整合遺傳信息，延長視網(wǎng)膜受累細胞壽命，維持視力[36]。人類基因組計劃的完成和基因測序技術的成熟，為基因治療大范圍用于治療視網(wǎng)膜相關疾病提供了樂觀前景。

然而，目前基因治療仍存在許多挑戰(zhàn)，臨床前階段向臨床成果轉(zhuǎn)化緩慢，侵入性治療對視網(wǎng)膜的損傷和相關并發(fā)癥，長期治療的耐受性和效果維持，治療費用昂貴，能否為治療其他遺傳性疾病帶來幫助等問題還需要進一步解決。

基因治療尚處在起步階段，隨著更加深入的研究和發(fā)現(xiàn)，越來越多疾病將通過這一極富前景的方法得到解決。