艾爾肯·肉孜比拉力, 焦 誼， 木葉斯?fàn)枴べI買提， 林 晨

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1生物化學(xué)暨分子生物學(xué)教研室， 2病理學(xué)教研室, 烏魯木齊 830011)

宮頸癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位，中國每年新發(fā)病例達(dá)13.15萬，死亡人數(shù)每年約5.3萬，新疆是宮頸癌高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率高達(dá)490/10萬[1-2]。近年研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)不僅提供了細(xì)胞黏附的物理支架，還參與調(diào)節(jié)許多生物學(xué)過程，如腫瘤細(xì)胞的生長、遷移、分化和內(nèi)穩(wěn)態(tài)等[3]。膠原蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)中含量最多的蛋白，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚存在爭議。本課題組前期研究中對(duì)宮頸癌和正常對(duì)照組織采用同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantization, iTRAQ)技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌中Ⅲ型膠原(COL3A1)和Ⅴ型膠原α1鏈(COL5A1)、α2鏈(COL5A2)呈下調(diào)表達(dá)，但其與宮頸癌的關(guān)系未見報(bào)道。

本研究選擇Ⅲ型膠原和Ⅴ型膠原蛋白，從基因轉(zhuǎn)錄水平 (mRNA)和蛋白質(zhì)表達(dá)水平探討其與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為揭示宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本組織標(biāo)本收集于本課題組前期收集的宮頸癌與正常對(duì)照組標(biāo)本，共計(jì)61例，其中宮頸鱗癌組織36例，非癌宮頸組織25例，新鮮組織經(jīng)液氮速凍，置于-80℃冰箱保存。另選取宮頸病變患者的存檔石蠟包埋組織標(biāo)本60例，其中宮頸癌 30例，非癌宮頸組織30例。所有入選病例術(shù)前均未接受放療或化療，也未患有其他惡性腫瘤。對(duì)照組非癌宮頸組織來自子宮肌瘤、子宮下垂、子宮腺肌癥等良性病變接受全子宮切除術(shù)的女性患者，患者年齡25～69歲。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備RNA提取的Trizol試劑(Invitrogen公司)，氯仿和異丙醇(上海生工)，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(K1622 Fermentas)，Real time RT-PCR SYBR Green1試劑盒(DRR041A，TAKARA)，抗體稀釋液(北京中杉)，Tris/EDTA修復(fù)液(pH9.0，北京中杉)，Anti-Collagen III抗體[FH-7A] (ab6310)，二抗(PV-6000北京中杉)，DAB試劑盒(北京中杉)，熒光定量PCR儀(IQ2 Bio-Rad 美國)，高速低溫離心機(jī)(ALLEGRA 64R，Beckmann Coulters，美國)，凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc XR，Biorad美國)，紫外分光光度計(jì)，(Nanodrop2000，Thermo Scientific，美國)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.3.1 組織總RNA的提取 取冷凍組織50～100 mg，在液氮冷凍狀態(tài)下碾碎后，采用Trizol試劑和氯仿方法提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度及純度，OD260/280=1.8～2.0，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外成像鑒定RNA質(zhì)量。

1.3.2 cDNA、引物設(shè)計(jì)與合成 提取質(zhì)量合格的RNA后定量到1 μg，以O(shè)ligo-dT為引物,參照 PrimeScript RT reagent Kit 說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄條件: 37℃ 15 min, 85℃ 5 s，所得cDNA置于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。引物設(shè)計(jì)與合成見表1。

表1 PCR引物序列信息

1.3.3 熒光定量PCR擴(kuò)增體系及循環(huán) 每管加TAKARA SYBR Premix Ex 12.5 μL，cDNA或標(biāo)準(zhǔn)樣品2 μL，上下游引物各0.5 μL，并加ddH2O 9.4 μL以使體系總體積達(dá)到25 μL，離心混均后置于熒光定量PCR儀中，95℃預(yù)變性3 min，然后95℃ 10 s，55℃～60℃ 30 s，最后在65℃～95℃ 10 s條件下，進(jìn)行循環(huán)，以建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線。

1.3.4 計(jì)算相對(duì)起始量將標(biāo)準(zhǔn)品用ddH2O做5倍倍比稀釋后，依次稀釋成8個(gè)數(shù)量級(jí)濃度梯度后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，(每個(gè)梯度至少做3份平行實(shí)驗(yàn))，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線各參數(shù)：線性范圍、相關(guān)系數(shù)R2、擴(kuò)增效率E。對(duì)于每種目的基因，iQ5 軟件會(huì)根據(jù)每個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和每個(gè)待測樣品的Ct值(Threshold Cycle，閾值循環(huán)數(shù)) 為每個(gè)樣品計(jì)算出 SQ 值(starting quantity，起始量)，即為該候選基因在該樣品中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。以β-actin為內(nèi)參基因，對(duì)每個(gè)待測樣品的候選基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到其標(biāo)準(zhǔn)化的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。表達(dá)水平(相對(duì)表達(dá)量)=目的基因的起始量/內(nèi)參基因的起始量。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

1.4.1 免疫組織化學(xué)(SP法)檢測 宮頸癌和對(duì)照組織均4μm厚連續(xù)切片，按常規(guī)方法脫蠟水化并用微波修復(fù)抗原。采用免疫組織化學(xué)SP法檢測，按試劑說明書進(jìn)行操作。滴加一抗(1∶400稀釋)4℃孵育過夜，生物素標(biāo)記的山羊抗兔/鼠二抗工作液室溫孵育15 min, DAB顯色，蘇木素復(fù)染。

1.4.2 結(jié)果判定 顯微鏡下膠原染色陽性區(qū)域?yàn)辄S色至深棕黃色, 按著色強(qiáng)度判定結(jié)果,顯色不明顯或無顯色為陰性(-),顯色淡黃色為弱陽性(+),顯色黃色為陽性(++),顯色為深棕黃色為強(qiáng)陽性(+++)。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組與對(duì)照組中COL3A1、COL5A1和COL5A2的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比，宮頸癌組織中COL3A1mRNA水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但COL5A1和COL5A2轉(zhuǎn)錄水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2、圖1。

表2 宮頸癌和對(duì)照組織內(nèi)COL3A1、COL5A1、COL5A2的mRNA水平

圖1 PCR熔解曲線

2.2 宮頸癌組與對(duì)照組中COL3A1免疫組化染色結(jié)果COL3A1表達(dá)于細(xì)胞外基質(zhì)中，呈卷曲網(wǎng)狀或條索狀(圖2)，在對(duì)照組織中為不同程度的陽性染色，陽性率 93.3%，在宮頸癌組織中多為陰性染色，陽性率為 23.3%(P<0.05)，見表3。

表3 COL3A1在宮頸癌組織及對(duì)照組織中的表達(dá)

圖2 COL3A1蛋白在宮頸癌和對(duì)照組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué))

3 討論

腫瘤微環(huán)境主要由腫瘤間質(zhì)成分所構(gòu)成，包括多種非腫瘤性的細(xì)胞成分以及細(xì)胞外基質(zhì)。膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，在保持個(gè)體完整性和調(diào)節(jié)體內(nèi)平衡中起到了重要作用[4]。膠原對(duì)腫瘤生長具有屏障作用，在一定程度上限制腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移[5]，但也有一些研究證實(shí)膠原具有促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的作用[6-7]。

本研究顯示宮頸癌組織內(nèi)COL3A1 基因和蛋白表達(dá)明顯降低。III型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)中第二豐富的膠原，通常分布在I型膠原附近。III型膠原蛋白是由3條α1(III)肽鏈組成的同源三聚體，在體內(nèi)分布廣，主要多見于皮膚，消化道，血管和子宮等彈性結(jié)締組織中，其編碼基因?yàn)镃OL3A1[8]。Becky等[9]在研究小鼠乳腺癌模型時(shí)，發(fā)現(xiàn)COL3A1缺陷型成纖維細(xì)胞來源的膠原更為密集和線性化，COL3A1缺陷型小鼠的原發(fā)腫瘤更易生長和轉(zhuǎn)移，說明III型膠原可以抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。還有研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌和乳腺癌中，血清中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)降解III型膠原產(chǎn)生的膠原片段C3M水平明顯升高，提示在腫瘤發(fā)展過程中，腫瘤組織中的III型膠原的降解增強(qiáng)[10]。但有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌腫瘤組織的中心區(qū)域和正常組織相比，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的邊緣組織中COL3A1 表達(dá)量顯著增加，并可通過激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，COL3A1在結(jié)直腸癌上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)與不良預(yù)后相關(guān)[11-12]。然而需要注意的是，細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白處于動(dòng)態(tài)變化的過程，由于細(xì)胞外基質(zhì)、腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)相互作用，腫瘤間質(zhì)膠原成分的演化最終可能導(dǎo)致COL3A1水平隨著時(shí)間的推移而增加，即使最初COL3A1的表達(dá)量很低。

V型膠原是一種具有調(diào)節(jié)作用的纖維形成膠原。它有多個(gè)不同的分子亞型，它們是由三種不同的多肽α鏈組成的——α1 (V)、α2 (V)和α3 (V)。研究發(fā)現(xiàn)V型膠原蛋白的增加通過促進(jìn)caspase依賴的凋亡型死亡而損害乳腺癌細(xì)胞的生存[13]；而在小鼠化學(xué)性肺癌模型中發(fā)現(xiàn)V型膠原蛋白的減少可使癌細(xì)胞凋亡減少，并且V型膠原表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致其與I型、III型膠原共聚合減少，從而促進(jìn)了癌細(xì)胞侵襲性和能動(dòng)性[14]。與之相反，有研究發(fā)現(xiàn)，COLV在胰管腺癌前體病變的基質(zhì)中逐漸積累，并通過激活FAK信號(hào)通路，影響癌細(xì)胞惡性表型的相關(guān)方面，直至形成轉(zhuǎn)移[15]。

本研究結(jié)果顯示COL5A1和COL5A2 mRNA水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與前期蛋白組學(xué)結(jié)果不一致，提示在宮頸癌發(fā)展過程中，膠原蛋白表達(dá)可在不同水平受到調(diào)控。在腫瘤發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生大量的MMPs以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的多種膠原蛋白，如COLV可被MMP-2和MMP-9降解，以至其正常結(jié)構(gòu)被破壞和腫瘤組織中含量降低[16]。通過膠原降解，原本光滑和卷曲的膠原結(jié)構(gòu)被破壞，膠原蛋白上的一些隱蔽的位點(diǎn)暴露，增加膠原蛋白交聯(lián)和沉積，引起細(xì)胞外基質(zhì)重塑，改變腫瘤微環(huán)境的穩(wěn)定性和間質(zhì)細(xì)胞極性，為腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移提供條件。

綜上所述，同一種膠原蛋白在不同的腫瘤中具有不同的功能，甚至在同一腫瘤的不同發(fā)展階段也會(huì)產(chǎn)生不同的作用。本研究明確了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與III型膠原蛋白表達(dá)水平和其編碼基因COL3A1轉(zhuǎn)錄水平下降存在密切關(guān)系，為后續(xù)功能和機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。