茆永娟，伏 慧，趙 梅，賈 偉△

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心，寧夏銀川 750004；3.寧夏臨床病原微生物重點實驗室，寧夏銀川 750004

20世紀(jì)80年代后期耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)出現(xiàn)以后，已經(jīng)在所有有人居住的大陸上發(fā)現(xiàn)了CRE，并且這些微生物引起的感染發(fā)生率在21世紀(jì)的前20年中穩(wěn)步增加[1-2]，是對公共衛(wèi)生的最重大威脅之一[3]。為了解寧夏地區(qū)某三甲綜合醫(yī)院臨床標(biāo)本分離的CRE的分布及耐藥情況，了解該醫(yī)院CRE耐藥基因的主要流行現(xiàn)狀，本研究對住院患者臨床分離的CRE菌株耐藥情況進行分析，并對耐藥基因進行檢測，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1菌株來源 收集2017 年1月1日至2018年12月31日寧夏地區(qū)某三甲綜合醫(yī)院住院患者臨床分離的CRE菌株。CRE納入標(biāo)準(zhǔn)參見2015年美國疾病控制與預(yù)防中心頒布的標(biāo)準(zhǔn)(《醫(yī)療機構(gòu)CRE防控指南》)。剔除同一患者相同部位分離的重復(fù)菌株。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706、肺炎克雷伯菌ATCC BAA 2146，均購自上海漢尼生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器與試劑 M-H 肉湯培養(yǎng)基和 VITEK-2 Compact 全自動微生物鑒定儀為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品；引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Premix Taq、DNA marker 購自寶生物工程(大連)有限公司；藥敏紙片購自英國 Oxoid 公司；抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)購自天津市大茂化學(xué)試劑公司。

1.3細(xì)菌鑒定及藥敏試驗 使用VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)及其配套革蘭陰性菌鑒定卡進行細(xì)菌鑒定和藥敏檢測。藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2018年標(biāo)準(zhǔn)進行判讀。質(zhì)控菌株藥敏結(jié)果在控，研究菌株結(jié)果方可納入數(shù)據(jù)分析。所得結(jié)果用Whonet5.6軟件進行分析。

1.4表型試驗和PCR耐藥基因擴增及blaNDM 亞型鑒定 將收集的每株CRE菌株同時進行改良碳青霉烯酶滅活(mCIM)試驗和乙二胺四乙酸-碳青霉烯酶滅活(eCIM)試驗聯(lián)合檢測。其中當(dāng)mCIM試驗結(jié)果為陽性時eCIM試驗結(jié)果才有意義；當(dāng)mCIM 試驗結(jié)果為陰性時，eCIM 試驗結(jié)果不作解釋，具體方法及結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI 2018年文件標(biāo)準(zhǔn)。采用煮沸法提取菌株DNA模板，通過參照相關(guān)文獻(xiàn)報道及NCBI網(wǎng)站設(shè)計并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，詳見表1。對常見的耐藥基因ESBLs(blaSHV、blaTEM)、碳青霉烯酶(blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48)進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。其中，基因型KPC、NDM陽性對照菌分別為本研究中經(jīng)測序確認(rèn)耐藥基因的7、27號菌，基因型SHV、TEM、OXA-48的陽性對照菌為31號菌，陰性對照均為質(zhì)控菌大腸埃希菌ATCC 25922。

表1 耐藥基因引物序列、產(chǎn)物長度和退火溫度

2 結(jié) 果

2.1CRE菌株的鑒定結(jié)果及科室分布 共收集到CRE菌株77株，其中肺炎克雷伯菌52株(67.53%)、大腸埃希菌25株(32.47%)。77株耐藥菌主要來自肝膽外科、重癥監(jiān)護室(ICU)和急診科，分別占25.97%、14.29%和11.69%。見表2。

表2 CRE菌株科室來源分布

2.2CRE菌株標(biāo)本來源分布情況 77株CRE菌株標(biāo)本來源主要為痰液、無菌中段尿、血液、膽囊及胰腺引流液等，見表3。

表3 CRE菌株標(biāo)本來源分布

2.3CRE菌株對臨床常用抗菌藥物的藥敏結(jié)果 CRE對常用抗菌藥物耐藥率均較高，對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率均大于95.00%，對喹諾酮類抗菌藥物耐藥率均在75.00%左右，對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥率也較高，其中對阿米卡星的耐藥率最低(19.48%)、敏感率最高(79.22%)。CRE菌株對常見抗菌藥物耐藥性見表4。

表4 CRE菌株對抗菌藥物的藥敏情況[n(%)]

2.4CRE菌株表型試驗與耐藥基因檢測結(jié)果 將77株CRE菌株進行mCIM與eCIM聯(lián)合試驗并對耐藥基因進行PCR擴增，其結(jié)果見表5、圖1、圖2。77株CRE中，58株mCIM試驗陽性，即產(chǎn)碳青霉烯酶，其中35株eCIM試驗陽性，即產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶；23株eCIM試驗陰性，即產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶。PCR擴增耐藥基因結(jié)果中，ESBLs基因以blaTEM為主，檢出率為49.35%，blaSHV檢出率為23.38%；碳青霉烯酶基因以blaNDM為主，檢出率為36.36%，其余blaKPC、blaOXA-48陽性率分別為24.68%、15.58%，未檢測到blaVIM和blaIMP基因。另外，有5株同時攜帶 blaKPC、blaSHV和blaTEM基因型；2株同時攜帶blaNDM、blaSHV和blaTEM基因型；2株同時攜帶blaNDM、blaKPC、blaOXA-48和blaTEM基因型；還有1株同時含有blaKPC、blaOXA-48、blaSHV和blaTEM基因型。對攜帶blaNDM耐藥基因的陽性產(chǎn)物經(jīng)測序和比對后，發(fā)現(xiàn)有 10 株為 blaNDM-1，18株為 blaNDM-5。

表5 CRE菌株mCIM聯(lián)合eCIM試驗及耐藥基因擴增結(jié)果

注：M為DL 1 000 marker；1為blaNDM;2為blaKPC;3為blaSHV;4為blaTEM;5為blaOXA-48。

注：A、B均為1號菌；C、D為2號菌。A、C顯示mCIM陽性；B顯示eCIM陰性；D顯示eCIM陽性。

3 討 論

本研究收集寧夏地區(qū)某三甲綜合醫(yī)院77株CRE菌株，菌株主要以肺炎克雷伯菌及大腸埃希菌為主。標(biāo)本來源主要為痰液、無菌中段尿、血液、膽囊及胰腺引流液等，科室分布主要集中在肝膽外科、ICU和急診科，另外燒傷與整形美容科、神經(jīng)外科、新生兒科、感染疾病科等科室均有CRE菌株檢出。本研究結(jié)果顯示，檢出的CRE菌株以肺炎克雷伯菌居多，原因可能有：第一，臨床標(biāo)本中來源于呼吸道的送檢量大，而存在于呼吸道的病原菌以肺炎克雷伯菌為主；第二，這些CRE菌株主要來自肝膽外科及ICU，據(jù)患者病歷資料顯示，這些患者多有嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病，免疫功能極度低下，有多部位感染傾向，使用抗菌藥物種類多且周期長，并且多數(shù)患者還要接受各種有創(chuàng)操作性治療，如氣管切開、氣管插管、中心靜脈置管、留置導(dǎo)尿管等，這些都為CRE的定植和感染提供了易感條件。這與其他相關(guān)研究中的報道相符[4-5]。

本研究對CRE進行藥敏試驗，結(jié)果顯示77株CRE菌株對臨床上的常用抗菌藥物明顯耐藥，對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率均大于95.00%，對喹諾酮類抗菌藥物耐藥率均在75.00%左右，對氨基糖苷類抗菌藥物也有一定的耐藥率。目前，多黏菌素E被視為CRE菌株感染治療中最后的選擇，但耐藥基因mcr-1的出現(xiàn)使臨床治療更為棘手[6]。下一步本課題組會對臨床菌株進行 mcr-1 的 PCR 檢測，明確其臨床分布，為研發(fā)有效的各類碳青霉烯酶抑制劑并解決腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的現(xiàn)狀提供可靠依據(jù)。

本研究通過對CRE進行耐藥基因檢測，發(fā)現(xiàn)ESBLs基因中blaTEM(49.35%)檢出率較高，blaSHV檢出率為23.38%；碳青霉烯酶基因以blaNDM為主，檢出率為36.36%，其余blaKPC(24.68%)、blaOXA-48(15.58%)均有檢出，而未檢測到blaVIM和blaIMP基因。該結(jié)果表明寧夏某三甲綜合醫(yī)院CRE的ESBLs基因以blaTEM為主；主要的碳青霉烯酶基因為 blaNDM，與我國大部分地區(qū)[7-8]以KPC基因型流行為主不同，分析其原因可能與菌株來源和地理條件等因素有關(guān)[9]。說明細(xì)菌的耐藥性具有地域差異性，不同地區(qū)耐藥基因分布不同，因此，應(yīng)該根據(jù)當(dāng)?shù)啬退幘哪退幪攸c來合理選擇抗菌藥物。另外，在本研究中，碳青霉烯酶基因blaNDM檢測出 blaNDM-1 和 blaNDM-5 兩種亞型,且以blaNDM-5亞型為主。2010 年KUMARASAMY等[10]首次報道了 NDM-1的出現(xiàn)，NDM-1 是目前臨床上最重要的金屬酶之一，能水解除氨曲南以外的所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物。自 NDM-1 被報道以后，世界各地現(xiàn)已報道有17 種 NDM亞型，不同NDM 亞型在酶活性和致病性上可能有差別。2016 年我國首次報道了產(chǎn)NDM-5的大腸埃希菌[11]，之后陸續(xù)出現(xiàn)關(guān)于 blaNDM-5 型耐藥基因的報道，不同的 blaNDM 亞型由于其個別堿基的不同，可能導(dǎo)致其水解活性的差異。blaNDM 亞型的出現(xiàn)表明 blaNDM 可能正處于快速進化過程中而導(dǎo)致其廣泛傳播。

本研究根據(jù)CLSI建議，首次將eCIM與mCIM聯(lián)合試驗對CRE菌株進行表型檢測，結(jié)果顯示77株CRE菌株中有58株產(chǎn)碳青霉烯酶，其中有35株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶，23株產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶。同時參考碳青霉烯酶基因的基因型檢測方法，兩者檢測結(jié)果相比較有差異。分析其原因：一方面可能表型試驗存在假陽性與假陰性結(jié)果；另一方面本研究僅檢測了5種常見的碳青霉烯酶耐藥基因，可能耐藥基因型覆蓋面不全面，所以有待后續(xù)研究從基因水平進一步完善。本研究中，產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的CRE構(gòu)成比較絲氨酸碳青霉烯酶偏高，然而目前臨床上抑制β-內(nèi)酰胺酶的主要藥物有克拉維酸、舒巴坦、三唑巴坦，但其僅對幾種絲氨酸類碳青霉烯酶有抑制作用。目前，新型抗菌藥物頭孢他啶/阿維巴坦對大多數(shù)ESBLs、絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素β-內(nèi)酰胺酶有抑制活性，但對新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶沒有活性[12]。因此，通過表型試驗初步檢測區(qū)分產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶和絲氨酸碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌，對于制訂合理優(yōu)先使用抗菌藥物管理計劃有重要意義，可為新藥的合理使用提供依據(jù)。

綜上所述，CRE感染已是臨床面臨的較為棘手的問題之一，本研究通過對CRE的臨床分布、耐藥基因分型和耐藥特征等進行分析檢測，為全面了解醫(yī)院腸桿菌科細(xì)菌的流行現(xiàn)狀及耐藥機制提供了依據(jù)，也為今后臨床上更有效地控制CRE引起的感染暴發(fā)和流行提供更可靠的治療依據(jù)。