范民婷 ，姜東琪，張?jiān)剖?，李玲玉，?穎，陳 珊，代志國(guó)，孫舒揚(yáng)*，趙玉平

（1.煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005；2.魯東大學(xué) 食品工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025）

黑樹莓（Rubus mesogaeus）屬于薔薇科懸鉤子屬，多年生落葉灌木，果實(shí)為小漿果，富含多種活性物質(zhì)成分（如多酚、鞣花酸、黃酮、維生素C等），具有抑菌、保護(hù)肝臟、抗氧化活性等功用[1-3]。黑樹莓果實(shí)易破碎，也不耐貯藏和運(yùn)輸，加之如今的保鮮技術(shù)尚不完善，因此如果不能及時(shí)消化易導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。現(xiàn)今黑樹莓鮮果除了少量被直接售賣外，大部分均需進(jìn)行速凍保存或精深加工。黑樹莓酒是黑樹莓果實(shí)進(jìn)行加工的一條有效途徑，不僅保留了果實(shí)中大部分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還具有促進(jìn)人體的新陳代謝、改善心腦血管、抗衰老、保護(hù)肝臟等功能[4-6]，具有廣闊的市場(chǎng)發(fā)展前景，因此急需大力開發(fā)其相關(guān)產(chǎn)品。

在果酒的生產(chǎn)過程中，釀造微生物有著舉足輕重的作用。一般而言，果酒的發(fā)酵過程包含兩個(gè)階段，即酒精發(fā)酵（alcoholic fermentation，AF）和蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）[7]。酒精發(fā)酵是在釀酒酵母的主導(dǎo)作用下進(jìn)行，分解糖類形成酒精及其他代謝產(chǎn)物[8-9]。蘋果酸-乳酸發(fā)酵主要由乳酸菌啟動(dòng)，旨在降低酒體中的酸度，提高酒的適口性，同時(shí)增加其生物穩(wěn)定性[10-11]。果酒發(fā)酵可以自然進(jìn)行，也可以在接種特定的釀造微生物后進(jìn)行，兩者各具有一定的優(yōu)缺點(diǎn)。自然發(fā)酵的果酒能夠最大限度地體現(xiàn)果實(shí)的風(fēng)味特征，在凸顯果酒的骨架感、復(fù)雜性和地域特色等方面優(yōu)勢(shì)明顯，但是自然發(fā)酵往往存在起酵晚、易停滯、重復(fù)性低、揮發(fā)酸含量高等缺陷。現(xiàn)代果酒釀造工藝使用商業(yè)化釀造微生物保障發(fā)酵過程，具有快速、高效、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，但也存在風(fēng)味不夠濃郁、地域特色缺乏及產(chǎn)品同質(zhì)化等問題[8，12]。目前對(duì)于果酒自然發(fā)酵微生物多樣性的研究中，越來越多學(xué)者使用高通量測(cè)序技術(shù)。作為新一代測(cè)序技術(shù)，高通量測(cè)序技術(shù)具有通量高，準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)[13]。陰芳冉[14]采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樹莓自然發(fā)酵中真菌進(jìn)行研究，結(jié)果顯示兩種樣品中釀酒酵母屬（Saccharomyces cerevisiae）和漢遜酵母屬（Hanseniaspora uvarum）均為優(yōu)勢(shì)菌群。PINTO C等[15]對(duì)自然發(fā)酵的葡萄酒采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在酒精發(fā)酵階段，釀酒酵母屬（Saccharomyces）和梅奇酵母屬（Metschnikowia）、漢遜酵母屬（Hanseniaspora uvarum）、孢子絲菌屬（Sporothrix）、念珠菌屬（Candida）、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces）等非釀酒酵母菌屬為主要真菌。

本課題以自然發(fā)酵的黑樹莓酒為研究對(duì)象，探究其自然發(fā)酵過程中的微生物群落構(gòu)成、結(jié)構(gòu)及演替變化規(guī)律，通過高通量測(cè)序技術(shù)分別測(cè)定黑樹莓酒自然酒精發(fā)酵階段的真菌群落結(jié)構(gòu)和自然階段蘋果酸-乳酸發(fā)酵的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，關(guān)注優(yōu)勢(shì)菌群，以期為后續(xù)黑樹莓酒發(fā)酵機(jī)理及品質(zhì)提升提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

黑樹莓（Rubus mesogaeus）（Hull，赫爾）：2017年7月采摘，速凍后將其存貯于-20 ℃的冷庫(kù)中，于2018年3月開始發(fā)酵。

1.1.2 化學(xué)試劑

果膠酶（30 000 U/g）：山東隆大生物生物工程有限公司；E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Kit試劑盒：美國(guó)OMEGA公司；2×TaqMaster Mix：南京諾唯贊生物科技有限公司；Qubit 3.0 DNA檢測(cè)試劑盒：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-250生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；5424臺(tái)式高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；FE20K pH計(jì)：瑞士梅特勒-托利多公司；DYCP-31C水平電泳儀：北京市六一儀器廠；C1000聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 黑樹莓酒釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

黑樹莓→解凍→挑選→破碎→酶解→成分調(diào)整→酒精發(fā)酵→離心出酒渣→蘋果酸-乳酸發(fā)酵→黑樹莓酒

操作要點(diǎn)：速凍黑樹莓室溫條件下解凍后破碎，置于20 L發(fā)酵瓶中，裝液量為15 L。添加果膠酶30 mg/L、二氧化硫50 mg/L、適量的蔗糖至還原糖含量為210 g/L[16]。在24～26 ℃條件下進(jìn)行自然酒精發(fā)酵，定期攪拌循環(huán)且跟蹤監(jiān)測(cè)黑樹莓酒的還原糖濃度，待酒體的還原糖含量＜4 g/L時(shí)，7 000 r/min離心15 min分離出酒渣，終止酒精發(fā)酵。而后控制溫度為20～22 ℃，進(jìn)行自然蘋果酸-乳酸發(fā)酵，跟蹤監(jiān)測(cè)蘋果酸濃度，待蘋果酸質(zhì)量濃度下降至0.5 g/L以下，終止蘋果酸-乳酸發(fā)酵，12 000 r/min離心10 min，除去發(fā)酵殘?jiān)?，得到黑樹莓酒，并測(cè)定黑樹莓酒的基本理化指標(biāo)。

1.3.2 理化指標(biāo)測(cè)定

還原糖、總酸、揮發(fā)酸、酒精度的測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，具體方法如下：采用斐林試劑法測(cè)定還原糖（以葡萄糖計(jì)）；采用氫氧化鈉滴定法測(cè)定總酸（以蘋果酸計(jì)）和揮發(fā)酸（以乙酸計(jì)）；采用密度瓶法測(cè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)；采用酸度計(jì)測(cè)定pH值[17]。

1.3.3 微生物多樣性分析

AF是在酵母作用下完成的，而MLF是由乳酸菌啟動(dòng)并完成的[18]，即酵母菌和乳酸菌分別在AF階段和MLF階段中起主導(dǎo)作用。因此在AF的第1天、第3天以及第6天分別收集樣品進(jìn)行真菌多樣性分析；在MLF發(fā)酵的第2天、第10天、第19天以及第28天收集樣品進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析。樣品放置于-80 ℃冰箱保存。

根據(jù)E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的操作說明，提取各樣品中的微生物總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。使用Qubit 3.0 DNA test kit檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量和濃度。真菌多樣性使用ITS1-2通用引物ITS1F（ccctacacgacgctcttccgatctn（標(biāo)簽）CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2R（gtgactggagttccttggcacccgagaattccaGCTGCGTTCTTCATCGATGC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增；細(xì)菌多樣性使用16S rRNA基因V3-V4區(qū)引物341F（5'-ccctacacgacgctcttccgatctg（標(biāo)簽）CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和805R（5'-gactggagttccttggcacccgagaattccaGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用磁珠純化回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。送樣至上海生工生物工程股份有限公司，使用Illumina Miseq平臺(tái)運(yùn)行PE300模式進(jìn)行高通量測(cè)序分析。

使用軟件Cutadapt、Pear和Prinseq對(duì)原始序列進(jìn)行去除接頭、序列拼接和質(zhì)量剪切，通過軟件Uchime進(jìn)行嵌合體和非特異性擴(kuò)增序列的去除。用Usearch軟件按照97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，在進(jìn)一步分析之前，除去在總序列中占比少于0.01%的OTU[19]。選擇豐度最高的序列作為OTU的代表性序列，利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，依據(jù)各樣品物種豐富度情況，通過得到的OTU結(jié)果計(jì)算出樣品中生物多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)（Chao、ACE指數(shù)）、覆蓋率指數(shù)（Coverage）、多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson指數(shù)）等[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然酒精發(fā)酵過程中的真菌多樣性

黑樹莓酒的自然AF共進(jìn)行了7 d，發(fā)酵過程中通過測(cè)定還原糖濃度來監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程。由于酒精發(fā)酵過程中酵母是優(yōu)勢(shì)菌群，所以真菌多樣性分析成為了黑樹莓酒自然AF的研究重點(diǎn)。在AF的初期（第1天）、中期（第3天）和后期（第6天）分別取樣，記為BU1、BU3和BU6，進(jìn)行高通量測(cè)序后實(shí)施系統(tǒng)分析。

2.1.1 高通量測(cè)序結(jié)果

不同發(fā)酵時(shí)期樣品的稀釋性曲線和Shannon指數(shù)分析結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著測(cè)序深度的不斷增加，OTU的數(shù)量也隨其增多，且樣品的Shannon曲線都已進(jìn)入平臺(tái)期階段。盡管隨著測(cè)序量的增加可能會(huì)發(fā)現(xiàn)新的OTU，但是樣品的真菌多樣性不會(huì)再隨著測(cè)序量的增加而發(fā)生變化，證明測(cè)序數(shù)量足夠，并且能夠反映出黑樹莓酒自然酒精發(fā)酵過程當(dāng)中的絕大多數(shù)真菌信息。

圖1 自然酒精發(fā)酵過程中真菌的稀釋性曲線（a）和Shannon指數(shù)（b）Fig.1 Rarefaction curve (a) and Shannon index (b) of fungi during spontaneous alcohol fermentation

2.1.2 真菌豐度和多樣性分析

圖2 自然酒精發(fā)酵過程中真菌OTU韋恩圖Fig.2 Venn diagram for fungal OTU during spontaneous alcoholic fermentation

由圖1、圖2可知，BU1、BU3和BU6組分別獲得62 318、56 162、71 541條有效序列。按照97%的相似度，樣品OTU數(shù)量分別為225、316和347，其中39個(gè)OTU在樣品BU1、BU3和BU6同時(shí)出現(xiàn)，62個(gè)OTU在樣品BU1和BU3中同時(shí)出現(xiàn)，120個(gè)OTU在樣品BU3和BU6中同時(shí)出現(xiàn)。結(jié)果表明，BU6的物種豐度高于其他不同發(fā)酵時(shí)期樣品，隨著發(fā)酵的進(jìn)行真菌群落多樣性先下降再上升，發(fā)酵接近結(jié)束時(shí)真菌群落結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜。

2.1.3 真菌群落組成分析

對(duì)BU1、BU3和BU6不同發(fā)酵時(shí)期樣品的真菌群落組成進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，酵母屬（Saccharomyces）、彎擔(dān)菌屬（Curvibasidium）和木拉克酵母屬（Mrakia）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，枝孢菌屬（Cladosporium）相對(duì)豐度也較高，其余真菌屬的相對(duì)豐度均＜2%。BU1樣品中的優(yōu)勢(shì)真菌為Curvibasidium（64.91%）、Mrakia（27.2%）和Cladosporium（4.05%）。BOURRET T B等[21]在釀酒葡萄表皮曾分離獲得Curvibasidium rogersii和Curvibasidium cygneicollum，該屬真菌能產(chǎn)生冬孢子使其抗逆性更強(qiáng)，并抵御寒冷。Mrakia屬的菌株大多分離于寒冷地區(qū)，屬于耐寒微生物[22]。筆者推測(cè)，由于黑樹莓果實(shí)長(zhǎng)期貯存于-20 ℃冷庫(kù)，適于耐寒類微生物富集培養(yǎng)，因此Cladosporium屬和Mrakia屬的真菌豐度較高。該結(jié)果也與前人的研究一致，DEL CARMENPORTILLO M等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵的初期階段非釀酒酵母豐度較高，其后會(huì)逐步下降。在黑樹莓酒自然AF中期（第3天），Curvibasidium和Mrakia的豐度迅速下降，而酵母屬（Saccharomyces）成為優(yōu)勢(shì)菌，豐度最大達(dá)到82.18%。經(jīng)進(jìn)一步分析，確認(rèn)該酵母在種的水平上是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），其利用糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成為乙醇，是AF中最重要的微生物[24]。釀酒酵母在實(shí)現(xiàn)自身增殖的同時(shí)顯著抑制了Curvibasidium、Mrakia及其他微生物的生長(zhǎng)。在發(fā)酵的第6天，Saccharomyces的豐度略有下降（75.53%），但仍然是優(yōu)勢(shì)微生物，主導(dǎo)著發(fā)酵進(jìn)程；其他真菌的豐度也有所變化，如Curvibasidium增長(zhǎng)至15.65%，Mrakia繼續(xù)下降至7.28%，而其他真菌的總比重不超過1.6%。

圖3 基于屬水平的樣品真菌分布Fig.3 Fungal community composition in samples at genus level

2.2 自然蘋果酸乳酸發(fā)酵過程中的細(xì)菌多樣性

酒精發(fā)酵結(jié)束后，離心除去真菌和酒渣，并于20～22 ℃開始自然蘋果酸乳酸發(fā)酵（MLF）。MLF過程主要由降酸類的乳酸菌進(jìn)行主導(dǎo)，將黑樹莓酒中的蘋果酸分解形成乳酸，解決酒體酸澀度過高的問題。黑樹莓酒的MLF持續(xù)了31 d，在發(fā)酵的前期（第2天）、中期（第10天、第19天）和后期（第28天）分別取樣，記為M2d、M10d、M19d和M28d，并進(jìn)行多樣性分析。由于MLF過程中細(xì)菌是優(yōu)勢(shì)菌，所以該發(fā)酵階段重點(diǎn)關(guān)注細(xì)菌的多樣性。

2.2.1 高通量測(cè)序結(jié)果

M2d、M10d、M19d和M28d不同發(fā)酵時(shí)期樣品的稀釋性曲線和Shannon指數(shù)分析結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著測(cè)序深度的增加，OTU的數(shù)量隨之增多，且樣品的Shannon曲線都已經(jīng)進(jìn)入平臺(tái)期階段。結(jié)果表明，測(cè)序數(shù)量充足，并且能夠反映出黑樹莓酒MLF發(fā)酵過程當(dāng)中絕大多數(shù)細(xì)菌的信息。

圖4 自然蘋果酸乳酸發(fā)酵過程中細(xì)菌的稀釋性曲線（a）和Shannon指數(shù)（b）Fig.4 Rarefaction curve (a) and Shannon index (b) of bacteria during spontaneous malolactic fermentation

2.2.2 細(xì)菌豐度和多樣性分析

由圖5可知，M2d、M10d、M19d和M28d組各獲得47 089、41 714、38 345和36 881條有效序列。按照97%的相似度，樣品中的OTU數(shù)目分別為1 900、2 012、2 315和2 420，其中221個(gè)OTU在所有樣品中同時(shí)出現(xiàn)，454個(gè)OTU在樣品M2d和M10d中同時(shí)出現(xiàn)，794個(gè)OTU在樣品M10d和M19d中重復(fù)，976個(gè)OTU在樣品M19d和M28d中同時(shí)出現(xiàn)。覆蓋率范圍為95%～97%之間，表明所測(cè)得的OTU能夠反映樣品的細(xì)菌組成。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)結(jié)果一致，Shannon指數(shù)分別為2.44、3.56、4.12和4.85，Simpson指數(shù)分別為0.46、0.34、0.23和0.11，說明樣品M28d的物種豐度明顯高于樣品M2d、M10d和M19d，可見隨著發(fā)酵的進(jìn)行細(xì)菌群落多樣性逐漸上升，MLF發(fā)酵的第28天細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜。

圖5 自然蘋果酸乳酸發(fā)酵過程中細(xì)菌OTU韋恩圖Fig.5 Venn diagram for bacterial OTU during spontaneous malolactic fermentation

由圖6可知，在黑樹莓自發(fā)進(jìn)行的蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中，在屬的水平上，泛菌屬（Pantoea）的相對(duì)豐度占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，酒球菌屬（Oenococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、酸土單胞菌屬（Aciditerrimonas）和地芽孢桿菌屬（Geobacillus）也占有較高的比例，而乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、消化鏈球菌（Peptostreptococcus）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和鞘氨醇桿菌屬（Sphingobium）占有一定的比例。

圖6 基于屬水平的樣品細(xì)菌分布Fig.6 Bacterial community composition in samples at genus level

在蘋果酸-乳酸發(fā)酵初期（M2d），Pantoea（66.4%）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其次為Aciditerrimonas（10.1%）、Geobacillus（4.65%）和Lactococcus（4.44%）。發(fā)酵10 d時(shí)，Pantoea的相對(duì)豐度降低到50.28%，而Oenococcus的相對(duì)豐度則增加至19.4%，Lactococcus相對(duì)豐度上升為6.89%，而Geobacillus相對(duì)豐度（4.46%）變化不大。發(fā)酵19 d時(shí)，Pantoea含量進(jìn)一步下降，相對(duì)豐度為21.84%；Oenococcus含量進(jìn)一步增加，占比25.64%；Lactococcus也出現(xiàn)了小幅增長(zhǎng)，相對(duì)豐度達(dá)到10.38%。進(jìn)入發(fā)酵后期（M28d），Pantoea、Oenococcus和Lactococcus的相對(duì)豐度仍舊很高，占比分別達(dá)到18.94%、29.16%和17.11%，Aciditerrimonas含量較之發(fā)酵中期出現(xiàn)了下降，達(dá)到6.64%，而其他細(xì)菌包括Streptococcus、Brevundimonas、Peptostrep-tococcus、Sphingobium一直維持較低的豐度值，直至發(fā)酵結(jié)束，其總含量仍低于5%。

PINTO C等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄酒蘋果酸-乳酸發(fā)酵的起始、中間和終止階段，泛菌屬（Pantoea）的含量一般較高，與本研究結(jié)果一致。Oenococcus是完成蘋果酸-乳酸發(fā)酵的重要菌屬，一般具有優(yōu)良的耐酸性，可將果酒中的蘋果酸降解形成乳酸和CO2[25-26]，從而降低果酒的酸度，產(chǎn)生其他代謝產(chǎn)物可增強(qiáng)果酒的風(fēng)味，還可以增強(qiáng)酒中微生物的穩(wěn)定性[27]。在自然發(fā)酵的果酒中，Lactococcus和Lactobacillus的檢出率一般較高[28-29]，本研究中Lactococcus的相對(duì)豐度一直維持在4.44%～17.11%，而Lactobacillus則含量較低，推測(cè)可能是黑樹莓酒的高酸度環(huán)境抑制了乳桿菌生長(zhǎng)，不利于其增殖[9，30]。

2.3 黑樹莓酒理化指標(biāo)分析

在酒精發(fā)酵以及蘋果酸乳酸發(fā)酵完成之后，立即測(cè)定了黑樹莓酒體的各項(xiàng)理化指標(biāo)，結(jié)果見表1。由表1可知，AF完成后酒精度達(dá)到11.5%vol，還原糖質(zhì)量濃度也已降低至2.2 g/L，說明樹莓中天然存在的釀酒酵母能夠有效的將糖類轉(zhuǎn)化形成乙醇，完成酒精發(fā)酵。再者，較之樹莓果實(shí)，AF完成后的酒體總酸含量出現(xiàn)了小幅下降，pH有小幅上升，說明自然AF也可以實(shí)現(xiàn)少量的生物降酸。

表1 黑樹莓果實(shí)和黑樹莓酒基本理化指標(biāo)Table 1 Basic physical and chemical indicators of black raspberry fruit and wine

自然MLF后再次測(cè)定黑樹莓酒的各項(xiàng)理化指標(biāo)，結(jié)果顯示，較之AF剛結(jié)束時(shí)，酒體的酒精度和還原糖含量未出現(xiàn)明顯變化，但總酸含量下降明顯，達(dá)到1.78 g/L，表明固有的乳酸菌發(fā)揮了其降酸功能，進(jìn)而有效保障了MLF的順利進(jìn)行。此外，揮發(fā)酸含量有了明顯提升，增幅達(dá)到0.51 g/L。依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中規(guī)定，酒體中揮發(fā)酸的質(zhì)量濃度必須低于1.2 g/L，本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果表明自然發(fā)酵的黑樹莓酒揮發(fā)酸含量符合國(guó)標(biāo)規(guī)定[31]。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用高通量測(cè)序方法分析了自然發(fā)酵得到的黑樹莓酒中微生物菌群多樣性變化及其優(yōu)勢(shì)菌群演替過程。發(fā)酵過程主要分為自然酒精發(fā)酵和自然蘋果酸發(fā)酵，前者主要測(cè)定真菌菌群多樣性，后者主要測(cè)定細(xì)菌菌落組成。分析結(jié)果表明，在黑樹莓酒自發(fā)的酒精發(fā)酵過程中，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）增殖最快，其在AF初期占比較低，但在中期和后期的相對(duì)豐度達(dá)到75%以上。在自發(fā)MLF過程中，泛菌屬（Pantoea）、酒球菌屬（Oenococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）等占有較高的比例，其中生長(zhǎng)最旺盛的是Oenococcus，在發(fā)酵中期和后期的相對(duì)豐度均達(dá)到25%以上。自然發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定黑樹莓酒的各項(xiàng)理化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)酒體成分符合國(guó)標(biāo)要求，說明發(fā)酵成功。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的Oenococcus和Saccharomyces cerevisiae可能對(duì)黑樹莓酒的發(fā)酵具有重要作用，后期可考慮對(duì)其進(jìn)行針對(duì)性分離和篩選，以獲得黑樹莓酒發(fā)酵專用釀造菌株。

本研究結(jié)果對(duì)指導(dǎo)黑樹莓酒生產(chǎn)、穩(wěn)定酒的質(zhì)量具有一定的理論指導(dǎo)和實(shí)踐價(jià)值。在后續(xù)的探究中，可依據(jù)酒體中微生物菌群的演替情況，擬對(duì)發(fā)酵過程中的酒體理化指標(biāo)和風(fēng)味特征進(jìn)行深入分析，為解釋黑樹莓酒的發(fā)酵機(jī)理提供理論支持。