王天歌

(天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072)

超聲波是一種在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到普遍認(rèn)可的物理媒介，具有安全性高、成本低、應(yīng)用便捷等獨(dú)特優(yōu)勢，目前已在臨床的各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，涉及各類器官和醫(yī)學(xué)分支，例如用于醫(yī)學(xué)成像和診斷的低強(qiáng)度超聲波以及用于擊碎結(jié)石和腫瘤組織等的高強(qiáng)度超聲波。近年來，隨著國家提出要滿足重大疾病早期診療的要求，同時(shí)結(jié)合物理和工程等學(xué)科的技術(shù)發(fā)展，已經(jīng)開發(fā)出很多基于超聲波的新型技術(shù)，聲遺傳技術(shù)也隨之應(yīng)運(yùn)而生。這一技術(shù)的思路來自于光遺傳技術(shù)，光遺傳技術(shù)是通過激光調(diào)控光敏蛋白進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞活動(dòng)的一種新興技術(shù)，近年來備受關(guān)注并且在神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域取得了很多研究成果[1-2]。然而由于光遺傳技術(shù)利用激光作為細(xì)胞調(diào)控手段，仍然存在一些需要改善的問題，如穿透性低、定位不夠精準(zhǔn)、需要手術(shù)植入光纖以及激光熱效應(yīng)較強(qiáng)等[3-4]。聲遺傳技術(shù)憑借特有的非侵入性、精準(zhǔn)調(diào)控性、高安全性等優(yōu)勢[5-6]，能夠彌補(bǔ)光遺傳技術(shù)的一些缺陷，有望成為繼其之后極有發(fā)展前景的一項(xiàng)細(xì)胞調(diào)控技術(shù)。

聲遺傳技術(shù)的原理(圖1)主要是：通過基因工程技術(shù)將機(jī)械敏感通道蛋白的基因轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞，利用超聲波調(diào)控細(xì)胞特異性表達(dá)的機(jī)械敏感通道蛋白進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的行為活動(dòng)。其中所用的機(jī)械敏感通道蛋白可以感受超聲波產(chǎn)生的機(jī)械力從而打開通道，使細(xì)胞內(nèi)外的小分子主要是離子通過通道流動(dòng)，離子在細(xì)胞的很多重要行為活動(dòng)中都起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，因此通過不同的通道蛋白調(diào)控不同的離子流動(dòng)即可調(diào)控相應(yīng)的細(xì)胞行為。目前已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)的機(jī)械敏感通道蛋白的種類有很多，但應(yīng)用于聲遺傳技術(shù)研究的僅有幾種，主要包括大電導(dǎo)機(jī)械敏感離子通道(mechanosensitive channel of large conductance，MscL)、瞬時(shí)受體電位(transient receptor potential，TRP)離子通道、雙孔鉀通道家族(channels of the two-pore-domain potassium family，K2P)和Piezo離子通道等[7]。它們大多數(shù)都能夠?qū)Φ蛷?qiáng)度的超聲波產(chǎn)生響應(yīng)，因此，聲遺傳技術(shù)中所使用的超聲波對(duì)機(jī)體的損傷極小。作者對(duì)聲遺傳技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行綜述，包括神經(jīng)細(xì)胞調(diào)控、目的基因表達(dá)調(diào)控及腫瘤細(xì)胞死亡調(diào)控等方面，并對(duì)聲遺傳技術(shù)面臨的機(jī)遇和挑戰(zhàn)進(jìn)行分析，以期為聲遺傳技術(shù)的進(jìn)一步深入研究和發(fā)展提供參考。

圖1 聲遺傳技術(shù)原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of principle of sonogenetics technology

1 聲遺傳技術(shù)的應(yīng)用

目前，對(duì)各類機(jī)械敏感通道蛋白的分子結(jié)構(gòu)及開放機(jī)理等特性已經(jīng)研究的比較透徹，并且在構(gòu)建性能更好的突變體蛋白方面也得到了一定的發(fā)展，通道蛋白在動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)和對(duì)超聲波的響應(yīng)性也得到了驗(yàn)證。如Doerner等[8]證明了來源于原核生物的 MscL野生型和突變體蛋白可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中成功表達(dá)并發(fā)揮作用；Heureaux等[9]利用偶聯(lián)到細(xì)胞表面的微泡對(duì)超聲波強(qiáng)度的放大作用，成功通過低強(qiáng)度超聲波調(diào)控MscL的開放。這些研究為聲遺傳技術(shù)在各方面的應(yīng)用奠定了重要的基礎(chǔ)。

1.1 在神經(jīng)細(xì)胞調(diào)控方面的應(yīng)用

聲遺傳技術(shù)最先在調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞放電領(lǐng)域得到應(yīng)用。超聲波作為損傷極小、穿透能力很強(qiáng)的介質(zhì)用于刺激神經(jīng)元放電具有很大的優(yōu)勢，可以安全傳入大腦深層。研究者曾單獨(dú)使用超聲波來刺激幾種模型生物的大腦神經(jīng)元簇，但作用范圍較廣，無法刺激單個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞，精確度很低[10-12]。利用聲遺傳技術(shù)能夠通過打開特定離子通道來激活特定的神經(jīng)細(xì)胞，雖然目前只停留在低等生物個(gè)體與哺乳動(dòng)物細(xì)胞層面，但有望為大腦神經(jīng)調(diào)控提供一種精確度高、調(diào)控效果好的新策略。

1.1.1 激活神經(jīng)元

Ibsen等[13]研究了在線蟲神經(jīng)元上表達(dá)的TRP-4通道蛋白對(duì)低強(qiáng)度超聲波的響應(yīng)性，以及由此產(chǎn)生的神經(jīng)元激活和線蟲行為活動(dòng)改變。發(fā)現(xiàn)，TRP-4通道蛋白對(duì)低強(qiáng)度超聲波敏感性很弱，不能直接被激活，但可以借助微氣泡將低強(qiáng)度的機(jī)械信號(hào)放大，從而使負(fù)壓峰值在0.4～0.6 MPa之間的低強(qiáng)度超聲波可以特異性激活表達(dá)TRP-4通道蛋白的神經(jīng)元。該研究中利用的全氟己烷微泡目前已被廣泛用作體內(nèi)超聲造影劑[14-16]，可以通過靜脈注射在體內(nèi)循環(huán)并保持1 h左右，為機(jī)械敏感性較低的通道蛋白在聲遺傳技術(shù)中的應(yīng)用提供了一個(gè)安全而有效的輔助工具。他們還發(fā)現(xiàn)，利用超聲波激活特異性表達(dá)TRP-4通道蛋白的不同神經(jīng)元，會(huì)導(dǎo)致不同的線蟲個(gè)體的行為改變。例如，激活A(yù)SH和AWC感覺神經(jīng)元會(huì)增加線蟲的大角度逆轉(zhuǎn)行為，而激活PVD神經(jīng)元?jiǎng)t會(huì)抑制這種行為。這一研究為探索不同的神經(jīng)元在影響動(dòng)物個(gè)體行為方面的功能提供了一種全新的、非侵入性的方法。而且，TRP-4通道蛋白不具有哺乳動(dòng)物同源性[17-18]，因此，在哺乳動(dòng)物大腦中表達(dá)這些通道蛋白相對(duì)來說是很安全的，有望在哺乳動(dòng)物中得到進(jìn)一步應(yīng)用。

1.1.2 改變細(xì)胞膜電位

神經(jīng)元的激活依賴于細(xì)胞膜電位的改變，即動(dòng)作電位的產(chǎn)生。一些研究針對(duì)聲遺傳技術(shù)對(duì)細(xì)胞膜電位的影響進(jìn)行了探索。Kubanek等[19]研究了聚焦超聲在調(diào)節(jié)K2P離子通道的K+電流和Nav1.5通道的Na+電流中的作用。發(fā)現(xiàn)，頻率為10 MHz、功率為0.3～4.9 W·cm-2的聚焦超聲能夠刺激細(xì)胞產(chǎn)生平均約23% 的膜電流升高，證明了聚焦超聲可以成功激活機(jī)械敏感離子通道從而改變膜電位。他們還發(fā)現(xiàn)，超聲波刺激可以使表達(dá)Na+或Ca+機(jī)械敏感通道的細(xì)胞產(chǎn)生興奮，而對(duì)表達(dá)K+機(jī)械敏感通道的細(xì)胞產(chǎn)生抑制。該研究首次在單細(xì)胞水平上探究了超聲波對(duì)機(jī)械敏感離子通道的影響，證明了超聲波可以調(diào)節(jié)流經(jīng)特定離子通道的電流，并且這些離子通道在神經(jīng)元、視網(wǎng)膜、心臟等多種組織中都有表達(dá)[20-21]，具有廣闊的研究前景。

Ye等[22]研究了低強(qiáng)度超聲波在刺激哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位中的應(yīng)用，在原代培養(yǎng)的大鼠海馬體神經(jīng)元中特異性表達(dá)了MscL的功能獲得突變體蛋白MscL I92L，該突變體蛋白對(duì)超聲波的響應(yīng)更敏感，在超聲波的負(fù)壓峰值低至0.25 MPa時(shí)就可以開啟，并成功觸發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位。MscL I92L不需要微泡或其它配體的介導(dǎo)，并且其表達(dá)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞原本的電生理特性和存活情況沒有影響。因此，MscL I92L有潛力發(fā)展成為一種通用的調(diào)控神經(jīng)元或其它細(xì)胞活動(dòng)的非侵入性聲遺傳工具。

1.2 在目的基因表達(dá)調(diào)控中的應(yīng)用

離子不僅與細(xì)胞的膜電位有關(guān)，還可以通過激活信號(hào)通路來啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控蛋白的表達(dá)。因此，聲遺傳技術(shù)可以利用超聲波打開機(jī)械敏感離子通道，通過內(nèi)流的特定離子啟動(dòng)相應(yīng)的基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)的非侵入性精準(zhǔn)調(diào)控。Pan等[23]利用低強(qiáng)度超聲波結(jié)合微泡打開表達(dá)在細(xì)胞上的Piezo離子通道，通過孔道內(nèi)流的Ca2+在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可以使磷酸酶活化，活化T細(xì)胞核因子(NFAT)在磷酸酶的作用下發(fā)生去磷酸化反應(yīng)，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，在核內(nèi)與上游轉(zhuǎn)錄元件相結(jié)合，從而啟動(dòng)下游目的基因的轉(zhuǎn)錄和后續(xù)的蛋白表達(dá)。下游目的基因?yàn)榭删幊淌?，這一策略可以成功調(diào)控各種貼壁或懸浮細(xì)胞對(duì)熒光素酶和GFP等蛋白的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，他們設(shè)計(jì)了嵌合抗原受體(CAR)的Ca2+啟動(dòng)表達(dá)基因，成功利用超聲波調(diào)控T細(xì)胞中CAR蛋白的表達(dá)，并對(duì)腫瘤細(xì)胞具有識(shí)別和清除作用，實(shí)現(xiàn)了癌癥免疫治療的精準(zhǔn)聲控。這一策略可以利用超聲波對(duì)活細(xì)胞中的基因表達(dá)進(jìn)行無創(chuàng)的遠(yuǎn)程調(diào)控，具有高時(shí)空精準(zhǔn)性，并且通過對(duì)目的蛋白基因的設(shè)計(jì)，可以擴(kuò)展為對(duì)不同類型細(xì)胞的不同功能蛋白表達(dá)的調(diào)控，在癌癥等疾病治療方面有廣闊的應(yīng)用前景，也為神經(jīng)科學(xué)等其它方向提供了新的思路。

1.3 在腫瘤細(xì)胞死亡調(diào)控中的應(yīng)用

以上介紹的聲遺傳技術(shù)應(yīng)用都是基于短時(shí)間或脈沖式的超聲波，在機(jī)械敏感離子通道短暫性開啟的過程中，其觸發(fā)的離子流動(dòng)對(duì)細(xì)胞的活性及正常生理活動(dòng)不會(huì)產(chǎn)生影響。而Wen等[24]在最新的研究中針對(duì)通道持續(xù)性開啟對(duì)細(xì)胞的影響進(jìn)行了探索，他們利用MscL的兩種突變體蛋白V23A-MscL和G26C-MscL，V23A-MscL是一種功能獲得型突變體，它的通道能夠在正常生理環(huán)境下自發(fā)性開啟，而G26C-MscL是一種化學(xué)響應(yīng)型突變體，它會(huì)對(duì)其化學(xué)活化劑MTSET產(chǎn)生響應(yīng)從而打開通道。他們發(fā)現(xiàn)，MscL的持續(xù)性開啟會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)正常的穩(wěn)態(tài)環(huán)境，從而導(dǎo)致細(xì)胞胞漿空泡化壞死，并且在小鼠腫瘤模型中具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，為癌癥治療提供了一種新的策略。目前還沒有將這種細(xì)胞死亡誘導(dǎo)策略與超聲波的調(diào)控功能相結(jié)合的研究應(yīng)用，這可能是聲遺傳技術(shù)極有潛力的后續(xù)發(fā)展方向。

2 聲遺傳技術(shù)面臨的機(jī)遇和挑戰(zhàn)

聲遺傳技術(shù)的開發(fā)和發(fā)展為生物學(xué)的調(diào)控技術(shù)提供了全新的策略，但作為一種新興技術(shù)，目前其研究和應(yīng)用范圍仍十分有限，并且存在一些需要解決的問題，主要包括：(1)目前已發(fā)現(xiàn)的機(jī)械敏感通道蛋白種類很多，但適用于聲遺傳技術(shù)的很少，對(duì)各類蛋白超聲響應(yīng)性的研究和對(duì)性能更好的突變體蛋白的構(gòu)建是促進(jìn)聲遺傳技術(shù)發(fā)展的重要基礎(chǔ)。(2)目前大部分聲遺傳技術(shù)利用的通道蛋白都需要借助微泡等配體提高其對(duì)超聲波的敏感性[9，25]，限制了部分方向的應(yīng)用。(3)需要進(jìn)一步研究和完善適用于聲遺傳技術(shù)的各類型超聲儀器，以配合不同的應(yīng)用條件和需求。(4)聲遺傳技術(shù)的效果很大程度上依賴于細(xì)胞對(duì)機(jī)械敏感通道蛋白的表達(dá)效果，目前很多研究利用病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，仍存在一些爭議，因此需要進(jìn)一步提高蛋白轉(zhuǎn)染的安全性和表達(dá)效率。

聲遺傳技術(shù)目前雖然還不夠成熟，但其存在的問題有望通過后續(xù)的研究得到完善，并且其應(yīng)用領(lǐng)域有望得到進(jìn)一步拓展?？偟膩碚f，聲遺傳技術(shù)提供了一種通過外界手段非侵入式調(diào)控細(xì)胞行為及功能的全新策略，為神經(jīng)科學(xué)、免疫學(xué)、疾病治療等領(lǐng)域都開拓了新的方向，并且以其非侵入性、精準(zhǔn)調(diào)控性、高安全性、強(qiáng)穿透性等獨(dú)特優(yōu)勢，有望彌補(bǔ)目前調(diào)控手段的不足，并成為未來極有發(fā)展前景的重要技術(shù)。