白吉慶，王鵬飛，張姣姣，張 紅，王曉婷，張 晗,2，楊 琳,2，楊 蕾

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046； 2.陜西省中藥原料質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)服務(wù)中心，陜西 咸陽 712046；3.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710000)

小麥為禾本科植物小麥(TriticumaestivumL.)的干燥成熟果實(shí)[1]，浮小麥為其干燥輕浮癟瘦的果實(shí)[2]，其性涼，味甘咸，入心、脾、腎經(jīng)，具有止汗、除熱、益氣的功效，對(duì)自汗、盜汗、骨蒸勞熱等疾病有較好的療效[3-5]。葡萄糖是生命活動(dòng)中不可缺少的物質(zhì)，在新陳代謝過程中起著重要的作用[6]。棉子糖是由半乳糖、果糖和葡萄糖結(jié)合而成，主治體虛多汗，可以調(diào)節(jié)腸道內(nèi)細(xì)菌平衡，顯著改善腸道菌群，保護(hù)肝臟，增加機(jī)體免疫力，抗腫瘤，促進(jìn)鈣的吸收等[4,7-10]。2015年版《中國(guó)藥典》未對(duì)小麥、浮小麥的質(zhì)量控制做具體要求，僅在四部中記載了小麥、浮小麥的來源。本試驗(yàn)通過柱前衍生化[11-16]，采用高效液相色譜建立小麥、浮小麥中葡萄糖和棉子糖的含量測(cè)定方法，為小麥、浮小麥的質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

戴安 Ultimate 3000 全自動(dòng)高效液相色譜儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司，包含 Ultimate 3000 四元梯度泵、Ultimate 3000 自動(dòng)進(jìn)樣器、Ultimate 3000 二極管陣列檢測(cè)器、Chromeleon 6.8色譜工作站)；Discovery DV215CD 型雙量程電子分析天平(瑞士賽多利斯集團(tuán)，0.01 mg，0.1 mg)；Direct-Q 3UV 純化水機(jī)(默克密理博)；超聲清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；DFT-50A 手提式高速粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司制造)；HX-25 型電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海宜昌儀器紗篩廠)；德國(guó)Christ ALPHA 1-2LD plus 冷凍干燥機(jī)(上海甄明科學(xué)儀器有限公司)；TGL-16G 型臺(tái)式離心機(jī)；C18固相萃取柱(200 mg/3 mL，安捷倫科技有限公司)。

1.2 試劑與藥材

水為超純水(自制)；乙腈、甲醇(色譜純)購(gòu)自美國(guó)迪馬公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(純度 ≥ 99.0%)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純；葡萄糖對(duì)照品(HPLC ≥ 98%，批號(hào)：BCY-000577)購(gòu)自江西佰草源生物科技有限公司；棉子糖對(duì)照品(HPLC ≥ 98%，批號(hào)：BCY-01104)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；小麥、浮小麥藥材信息見表1。

表1 小麥、浮小麥樣品來源信息

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取工藝優(yōu)化

以葡糖糖、棉子糖含量為指標(biāo)綜合評(píng)分，按L9(34)正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，考察乙醇濃度(A)、超聲時(shí)間(B)和提取次數(shù)(C)三個(gè)因素的最佳提取工藝。每個(gè)因素三個(gè)水平，見表2。

表2 葡萄糖、棉子糖提取工藝因素水平表

1.3.2 葡糖糖、棉子糖含量測(cè)定

1.3.2.1 色譜條件 Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為 0.01 mol/L pH 值為7的乙酸銨緩沖液：乙腈(V/V，80∶20)；體積流量1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量5 μL。

1.3.2.2 PMP溶液的制備 精密稱取435 mg PMP，置5 mL的量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得；氫氧化鈉溶液的制備：精密稱取60 mg氫氧化鈉，置5 mL的量瓶中，加水溶解至刻度，即得。

1.3.2.3 對(duì)照品衍生溶液的制備 精密稱定葡萄糖對(duì)照品 5.85 mg，棉子糖對(duì)照品 6.61 mg，加PMP溶液和氫氧化鈉溶液各1 mL，置70℃水浴鍋中反應(yīng)1.5 h，用鹽酸調(diào)pH約7，加入1 mL二氯甲烷混勻，離心(13 000 r/min，5 min)，取上清液，用冰醋酸調(diào)pH 4～5，加入1 mL二氯甲烷混勻，至二氯甲烷萃取層近無色，取上清液于60℃水浴揮干，用1 mL水溶解，過C18小柱，先用3 mL水洗脫，棄去洗脫液，再用3 mL 25%乙腈洗脫，收集洗脫液，60℃水浴揮干，殘?jiān)芗尤? mL水充分溶解，過 0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為對(duì)照品衍生化溶液的儲(chǔ)備液。取上述儲(chǔ)備液適量加水稀釋成一系列濃度梯度的對(duì)照品衍生化溶液(葡萄糖衍生物質(zhì)量濃度分別為0.139 5、0.279、0.697 5、1.395、2.79 mg/mL，棉子糖衍生物質(zhì)量濃度分別為0.165 25、0.826 25、3.305、9.915、16.525、26.44 mg/mL)。

1.3.2.4 供試品衍生溶液的制備 取小麥、浮小麥粉末各3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理(80 W，45 kHz)30 min，放冷，再次稱定重量，用60%乙醇補(bǔ)足減失的重量，過濾，濾液于80℃水浴蒸干，殘?jiān)铀芙?，冷凍干燥。取凍干后樣? mg，精密稱定，按“1.3.2.3”項(xiàng)下的方法“自加PMP溶液和氫氧化鈉溶液各1 mL起”，進(jìn)行衍生化處理，即得供試品衍生化溶液。

1.3.2.5 線性關(guān)系 精密吸取“1.3.2.3”項(xiàng)下的溶液各1 μL注入液相色譜儀，測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo) (Y)，質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo) (X)，進(jìn)行線性回歸。

1.3.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“1.3.2.4”項(xiàng)下的同一供試品溶液1 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次， 按“1.3.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)供試品6份, 按“1.3.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品衍生化溶液, 按“1.3.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“1.3.2.4”項(xiàng)下的同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、16 h精密吸取1 μL，按“1.3.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

1.3.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的浮小麥、小麥粉末各6份，分別精密加入一定量的葡萄糖、棉子糖對(duì)照品，按“1.3.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品衍生化溶液，按“1.3.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。

1.3.2.10 樣品的含量測(cè)定 精密吸取“1.3.2.4”項(xiàng)下的供試品衍生化溶液各5 μL，按“1.3.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 葡萄糖、棉子糖提取工藝優(yōu)化

由表4、5可見，影響葡萄糖、棉子糖提取的因素主次順序?yàn)橐掖紳舛?超聲時(shí)間>提取次數(shù)，其中乙醇濃度對(duì)葡萄糖、棉子糖提取的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；超聲時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)提取工藝無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但由表3可知，提取30 min比提取15 min和45 min的含量高，提取次數(shù)對(duì)含量影響不大。綜合考慮，既要葡萄糖、棉子糖提取含量最高，又要節(jié)約成本，所以確定最佳提取工藝為A2B2C1，即用60%乙醇超聲30 min提取1次。

表3 優(yōu)化葡萄糖、棉子糖提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 葡萄糖含量方差分析結(jié)果

表5 棉子糖含量方差分析結(jié)果

2.2 色譜條件的優(yōu)化

采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了選擇。結(jié)果表明，檢測(cè)波長(zhǎng)在254 nm處，所得各色譜峰譜圖信息量較大，且色譜峰分離度較好，所以選用254 nm。對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行了優(yōu)化，最終選用“1.3.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行等度洗脫。

2.3 葡萄糖、棉子糖含量測(cè)定

所得回歸方程為：y葡萄糖=4.416 7x-0.086 2，R2=0.999 5，葡萄糖在0.139 5～2.79 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；y棉子糖=6.613 5x-0.690 3，R2=0.999 9，棉子糖在0.165～26.44 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。精密度試驗(yàn)中葡萄糖、棉子糖峰面積的RSD值分別為2.74%、1.46%，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)中葡萄糖、棉子糖峰面積的RSD值分別為2.31%、2.09%，表明16 h內(nèi)供試品的穩(wěn)定性良好；重復(fù)性試驗(yàn)中葡萄糖、棉子糖峰面積的RSD值分別為1.51%、1.76%，表明該方法的重復(fù)性良好；葡萄糖、棉子糖的平均回收率分別為98.7%(RSD=2.42%)、99.1%(RSD=2.81%)，表明該方法的回收率良好(表6)。小麥和浮小麥中葡萄糖、棉子糖含量見表7，對(duì)照品和供試品色譜圖見圖1。

表6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表7 小麥、浮小麥中葡萄糖與棉子糖的含量

圖1 對(duì)照品與供試品HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms of chemical reference substances and sample.注：A-棉子糖對(duì)照品；B-葡萄糖對(duì)照品；C-小麥供試品；D-浮小麥供試品

3 討論

本試驗(yàn)分別考察了提取溶劑(30%乙醇、60%乙醇、 90%乙醇)，超聲時(shí)間(15、30、60 min)和提取次數(shù)，結(jié)果60%乙醇超聲30 min 提取1次的樣品溶液的峰形好，峰面積較大，而且分離度較好?？疾炝朔磻?yīng)的水浴溫度和時(shí)間，表明在70℃水浴鍋中反應(yīng)1.5 h，反應(yīng)完全，故反應(yīng)溫度和時(shí)間確定為70℃水浴中反應(yīng)1.5 h。

本試驗(yàn)分別考察了流動(dòng)相乙腈-0.01 mol/L乙酸銨緩沖液、乙腈-0.03 mol/L乙酸銨緩沖液、乙腈-0.05 mol/L乙酸銨緩沖液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.01 mol/L乙酸銨緩沖液為流動(dòng)相，各色譜峰分離效果最好?？疾炝藱z測(cè)波長(zhǎng)245、254、265 nm，柱溫25、30、35℃，結(jié)果表明在254 nm和30℃下，色譜峰峰形好，吸收強(qiáng)度高。

含量測(cè)定結(jié)果表明：小麥中葡萄糖含量最高的是鳳翔縣崖彎村11.75 mg/mL，最低是鳳翔縣關(guān)家村6.19 mg/mL，棉子糖含量最高的是鳳翔縣白家凹村101.79 mg/mL，最低是鳳翔縣關(guān)家村55.28 mg/mL；浮小麥中葡萄糖含量最高的是鳳翔縣貸箭門前12.95 mg/mL，最低是鳳翔縣宋家村7.19 mg/mL，棉子糖含量最高的是鳳翔縣白家凹村137.05 mg/mL，最低是鳳翔縣關(guān)家村95.98 mg/mL。造成鳳翔縣各地葡萄糖和棉子糖含量差異的原因有待進(jìn)一步研究。小麥和浮小麥中棉子糖含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于葡萄糖含量。

本試驗(yàn)建立了不同產(chǎn)地小麥、浮小麥中葡萄糖和棉子糖的柱前衍生HPLC含量測(cè)定方法。方法學(xué)結(jié)果表明其精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，可為小麥、浮小麥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供試驗(yàn)依據(jù)。