黃小鳳，韋陽連*，余金昌，陶 旭，胡桂兵

(1.東莞植物園，廣東 東莞523086；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，廣東 廣州510642)

東莞是著名的荔枝之鄉(xiāng)，荔枝種植歷史悠久，其氣候、水土非常適合荔枝生長，積累了豐富的荔枝種質(zhì)資源，2000～2018年我國審(認)定了40個荔枝新品種，其中‘觀音綠’、‘冰荔’、‘唐夏紅’、‘嶺豐糯’、‘紅繡球’等優(yōu)良新品種均選育自東莞[1-6]。本課題組經(jīng)調(diào)查走訪，在東莞的各鎮(zhèn)街還發(fā)現(xiàn)一些民間流傳的優(yōu)質(zhì)荔枝種質(zhì)，如寮步鎮(zhèn)的‘白油麻’、茶山鎮(zhèn)的‘紫囊’、中堂的‘奉沖大造’、南城區(qū)的‘大紅帽’等。在對荔枝資源進行性狀調(diào)查過程中，發(fā)現(xiàn)來自東莞市茶山鎮(zhèn)南社村的‘紫囊’與來自東莞市大朗鎮(zhèn)水平村的‘紅繡球’(‘紅繡球’是廣東省農(nóng)作物品種審定委員會2003年審定的優(yōu)良品種)的果實性狀很相似，猜測可能為同一荔枝種質(zhì)。荔枝種質(zhì)同名異物或同物異名的現(xiàn)象，易造成生產(chǎn)和科研上混亂，為澄清荔枝種質(zhì)命名混亂和重復(fù)現(xiàn)象，便于荔枝種質(zhì)資源管理，通過對‘紫囊’和‘紅繡球’進行來源考證、引種觀察及SNP分子標(biāo)記分析，鑒定兩者是否為同物異名。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘紫囊’來源于廣東省東莞市茶山鎮(zhèn)南社村，是記載始于明代的傳統(tǒng)名優(yōu)荔枝種質(zhì)；‘紅繡球’來源于東莞市大朗鎮(zhèn)水平村。

1.2 來源考證

采用查閱文獻和實地走訪的方式進行。

1.3 引種觀察

2016年3月，以樹齡30年‘糯米糍’大樹為砧木，通過高接換種的方式，將‘紫囊’和‘紅繡球’的接穗嫁接到東莞植物園的荔枝園，每份種質(zhì)各嫁接5株。待其成活進入正常生長期后，每份種質(zhì)選擇3株進行物候期及果實性狀的觀測、比較。

1.4 SNP分子標(biāo)記

1.4.1 DNA準(zhǔn)備

將‘紫囊’和‘紅繡球’的葉片研磨后，用實驗室改良的CTAB小樣法提取DNA，使用瓊脂糖電泳以及核酸蛋白(Nanodrop ND-2000)測定儀測定DNA濃度與純度等數(shù)據(jù)后，DNA稀釋到一定倍數(shù)用于進行SNP標(biāo)記分析。

1.4.2 SNP分析

20對分型穩(wěn)定、多態(tài)性高的SNP引物(表1)參考Liu等[7]；SNP分型采用高分辨率溶解曲線技術(shù)(High resolution melting，HRM)，HRM分型引物的設(shè)計、HRM檢測及數(shù)據(jù)分析參考孫清明等[8]。

表1 本研究所用SNP引物信息

2 結(jié)果分析

2.1 種質(zhì)來源的比較

2014年，本課題組在查閱文獻進行東莞本地荔枝資源挖掘時發(fā)現(xiàn)，明末清初廣東著名的學(xué)者、詩人屈大均所著《喜謝九丈莞中見過之作》詩云“紫囊一樹人爭食，明歲招予作白猿”[9]，此詩描述的是屈大均到東莞市茶山鎮(zhèn)南社村吃過謝九丈【注：謝九丈即謝重華(1598～1679)，南社鄉(xiāng)農(nóng)、詩人，明遺民】培育的‘紫囊’后，極贊‘紫囊’荔枝的搶手，感嘆到：明年若能品嘗紫囊，請先招呼，我寧可到南社當(dāng)白猿，也要上樹摘吃。茶山鎮(zhèn)南社族譜有《樟崗記》載：“黃梅紫荔，錯落爭榮”，明確提出，‘紫囊’原來盛產(chǎn)于南社村的樟崗嶺，歷來與黃梅爭榮斗艷。由此可見，‘紫囊’迄今至少有300多年的栽培歷史，在東莞市茶山鎮(zhèn)曾經(jīng)栽培極為興盛。后經(jīng)實地走訪屈大均詩中描述的主人翁謝重華的后人謝進球先生得知，他的祖輩曾在金頭墓(南社一地方土名)種植‘紫囊’，前些年因山地征用這些荔枝樹要被砍，村民認為該荔枝品種品質(zhì)優(yōu)良應(yīng)保其后代，故取其芽條嫁接，種植在狗屎嶺(南社另一地方土名)，現(xiàn)僅剩此一株。但最早種植的‘紫囊’從何地引進謝家已無法考究。

根據(jù)《荔枝新品種紅繡球的選育》[1]一文記錄，‘紅繡球’是廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所的技術(shù)人員1997年在東莞市大朗鎮(zhèn)水平村發(fā)現(xiàn)的荔枝種質(zhì)，當(dāng)?shù)剞r(nóng)民認為該品種核小、成熟期與大種‘糯米糍’相近，誤認為是‘糯米糍’，但經(jīng)過調(diào)查分析，認為該品種性狀與‘糯米糍’沒有相似之處，不是‘糯米糍’。后經(jīng)AFLP鑒定，確認‘紅繡球’AFLP指紋圖譜存在特征帶，未發(fā)現(xiàn)與該品種同名異物、同物異名的特征帶，認定‘紅繡球’為新品種，并于2003年通過廣東省農(nóng)作物品種審定委員會審定。

對比‘紫囊’和‘紅繡球’的發(fā)現(xiàn)史可知，‘紅繡球’于1997年發(fā)現(xiàn)，2003年通過品種審定，而‘紫囊’雖至少有300多年的栽培歷史，卻于2014年才被挖掘出來，即‘紅繡球’在進行AFLP鑒定時，并未與‘紫囊’進行比較。

2.2 引種表現(xiàn)

2.2.1 植物學(xué)特性

高接3年后，‘紫囊’和‘紅繡球’的植物學(xué)特征基本一致。樹冠呈半圓形，樹高 3.5～4.0 m，冠幅 3.5 m ×3.5 m，接穗平均粗度6 cm，表皮呈灰褐色。羽狀復(fù)葉，對生，4～6片小葉，葉片披針形或長披針形，墨綠色，中等大小， 長8～12cm，寬2.5～3.5 cm，尖端漸尖，主側(cè)脈明顯，花序中等，雌花柱頭2裂。

2.2.2 物候期

自2017年1月至2019年12月，連續(xù)三年對‘紫囊’和‘紅繡球’進行物候期觀察發(fā)現(xiàn)，兩者的物候期基本一致。 每年可抽生3～4批新梢。白點期1月下旬，抽穗期2月中旬，初花期3月下旬，盛花期4月上旬，謝花期4月中旬，落果主要集中在 5月上旬，果實著色期6月上中旬，果實成熟期7月上旬。

2.2.3 果實特征

2019年6月，即高接后第三年， 在‘紫囊’和‘紅繡球’的結(jié)果樹中各自隨機選擇3株的果實進行果實特征觀測，結(jié)果表明‘紫囊’和‘紅繡球’的果形、果皮顏色、龜裂片特征、種子外觀、口感、風(fēng)味等特征一致。經(jīng)對二者果實的單果大小、單果重、可溶性固形物、可食率等進行比較發(fā)現(xiàn)，‘紫囊’的果實單果重、橫徑、側(cè)徑、果皮重、國核重、果肉重等略小于‘紅繡球’，但它們的果實縱徑、可溶性固形物和可食率基本一致。方差分析顯示，‘紫囊’和‘紅繡球’的果實特征指標(biāo)之間無顯著差異(表2)。

表2 ‘紫囊’和‘紅繡球’的果實特征比較

2.3 ‘紫囊’與‘紅繡球’的SNP分型結(jié)果

HRM分型結(jié)果表明，在20對特異性位點上，‘紫囊’荔枝與‘紅繡球’荔枝的分型結(jié)果一致(表3)，表明兩份材料在這20對特異性引物上所表現(xiàn)出的基因型完全一致。

表3 ‘紫囊’與‘紅繡球’的20對SNP位點分型

3 討論與結(jié)論

來源考證顯示，‘紫囊’與‘紅繡球’分別來源于東莞市的茶山鎮(zhèn)南社村和大朗鎮(zhèn)水平村，兩地相距約30 km?！夏摇怯涊d始于明代，發(fā)現(xiàn)于2014年，在當(dāng)?shù)貎H存一株的傳統(tǒng)荔枝種質(zhì)；‘紅繡球’是在大朗及周邊鎮(zhèn)、村都有種植，發(fā)現(xiàn)于1997年，審定于2003年的荔枝新品種。文獻考證和走訪調(diào)查都無法判斷‘紫囊’與‘紅繡球’在茶山鎮(zhèn)和大朗鎮(zhèn)之間有無相互傳播的可能，可確定的是‘紅繡球’在進行AFLP分子鑒定時，并未與‘紫囊’進行比對。兩者引種后所表現(xiàn)的植物學(xué)特征、物候期及果實性狀基本一致，兩者果實的形狀、果皮顏色、龜裂片特征、口感、風(fēng)味等特征一致，不同的是‘紫囊’的果實略小于‘紅繡球’的果實，但差異不顯著。傳統(tǒng)植物分類學(xué)認為，綠色開花植物分類的主要依據(jù)是花、果實和種子，‘紫囊’與‘紅繡球’的枝、葉、花、果實、種子性狀基本一致，在性狀鑒別層面上可將二者視為同一植物種類。

荔枝品種歸類主要依靠形態(tài)學(xué)特征，而表型可受環(huán)境影響，同一基因型在不同地區(qū)可能產(chǎn)生不同的表型，有些表型差異甚至很大，以至于給人新品種的誤判[10]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與技術(shù)成熟，分子標(biāo)記已逐漸成為果樹品種資源的鑒定與親緣關(guān)系的探究的不可缺少的技術(shù)手段之一。單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP)是同一個物種不同個體間染色體上遺傳密碼單個堿基的轉(zhuǎn)換、顛換以及單堿基的插入或缺失等，主要表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性[11]。SNP標(biāo)記是目前為止分布較為廣泛、應(yīng)用較多的一種標(biāo)記方法，在遺傳上高度穩(wěn)定，具有二等位性，非此即彼，在基因組篩選中只需+/-的分析，而不用分析片段的長度即可判定，易于自動化分型。由于具備上述的優(yōu)勢，SNP標(biāo)記已愈來愈成為品種鑒定的重要技術(shù)手段[12-15]。近年新審定荔枝品種‘御金球’及‘燎原’等即應(yīng)用了SNP標(biāo)記這一技術(shù)手段[8,16]。為進一步驗證‘紫囊’與‘紅繡球’是否為同一種質(zhì)，利用20對SNP引物對‘紫囊’與‘紅繡球’進行分子標(biāo)記研究，結(jié)果顯示它們在20對特異性引物上所表現(xiàn)出的基因型完全一致，即在分子水平上證實‘紫囊’與‘紅繡球’為同一種質(zhì)。

綜合引種觀察和SNP標(biāo)記研究結(jié)果，可以判定記載始于明代的東莞傳統(tǒng)名荔‘紫囊’與當(dāng)前栽培的‘紅繡球’為同一荔枝種質(zhì)，兩者屬同物異名。