楊蕊瓊，惠玲，馬俊，唐瑜

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000；2.聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科 甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050)

目前，全世界受到不孕不育癥困擾的育齡夫婦約10%～15%左右，其中男性不育約占 50%[1]。與其他細(xì)胞相比生殖細(xì)胞對(duì)DNA損傷劑極其敏感，生殖細(xì)胞DNA的損傷被認(rèn)為是導(dǎo)致生精失敗和男性不育的主要原因之一[2-3]。然而，人類基因組中存在一套完整的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)可應(yīng)對(duì)DNA損傷，從而保持基因組的完整性。DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)可歸納為堿基切除修復(fù)(Base excision repair，BER)、核苷酸切除修復(fù)(Nucleotide excision repair，NER)、錯(cuò)配修復(fù)(Mismatch repair，MMR)和雙鏈斷裂修復(fù)(Double-strand break repair，DSBR)。X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(X-ray repair cross-complementary gene 1，XRCC1)是第一個(gè)被克隆出來(lái)的在BER途徑中起關(guān)鍵作用的支架蛋白，可將不同成分招募到DNA損傷部位，提高BER修復(fù)途徑的效率[4]。XRCC1基因位于19q13.2，包含17個(gè)外顯子[5]。研究發(fā)現(xiàn)XRCC1單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)可能會(huì)改變DNA修復(fù)能力，并且可能會(huì)影響疾病易感性[6-7]。隨著DNA 測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)XRCC1基因常見(jiàn)的單核苷酸多態(tài)性有可能阻礙正常的精子發(fā)生，從而導(dǎo)致男性不育。目前XRCC1基因 Gln399Arg(rs25487)多態(tài)性與男性不育的關(guān)系尚存在爭(zhēng)議。本研究納入既往報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)，采用Meta分析以綜合評(píng)價(jià)XRCC1 rs25487多態(tài)性與男性不育發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。

資料與方法

一、文獻(xiàn)檢索

通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)檢索PubMed、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(CBM)、中國(guó)知網(wǎng)及萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的涉及XRCC1基因多態(tài)性與男性不育相關(guān)性的研究。中文數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)鍵詞選擇“人類X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1”“基因多態(tài)性”“XRCC1”“rs25487”及“男性不育”等。英文數(shù)據(jù)庫(kù)檢索詞選擇“X-ray repair cross-complementary gene 1”“XRCC1”“SNP”“rs25487”“polymorphism”和“male infertility”“Oligozoospermia”等。

二、文獻(xiàn)選擇標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)公開(kāi)發(fā)表的評(píng)價(jià)XRCC1單核苷酸多態(tài)性與男性不育相關(guān)性的中英文病例-對(duì)照研究；(2)研究對(duì)象為男性不育癥患者；(3)報(bào)道了病例組和對(duì)照組的各基因型頻數(shù)，并能計(jì)算出優(yōu)勢(shì)比(OR)及其95%可信區(qū)間(95%CI)；(4)同一研究若重復(fù)發(fā)表時(shí)取最新發(fā)表的文獻(xiàn)；(5)對(duì)照組基因型分布遵循哈迪-溫伯格平衡(Hard-Weinberg equilibrium，HWE)檢驗(yàn)。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)研究類型不是病例對(duì)照研究；(2)不能獲取原始數(shù)據(jù)，無(wú)法計(jì)算OR及95%CI；(3)對(duì)照組的基因型分布不符合HWE；(4)研究數(shù)據(jù)重復(fù)使用；(5)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奈墨I(xiàn)。

三、文獻(xiàn)篩選及質(zhì)量分析

文獻(xiàn)篩選工作由兩名研究人員嚴(yán)格按照納入及排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，并采用Endnote軟件篩選，互相核對(duì)，出現(xiàn)結(jié)果差異時(shí)與第3位評(píng)價(jià)員通過(guò)協(xié)商解決。對(duì)所納入文獻(xiàn)采用Newcastle-Ottawa scale(NOS)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量分析。

四、數(shù)據(jù)提取

對(duì)納入的文獻(xiàn)提取下列數(shù)據(jù)：(1)研究的基本信息(第一作者姓名、發(fā)表時(shí)間、研究地點(diǎn)、研究人群、研究類型)；(2)基因分型方法，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)、水解探針?lè)?TaqMan)等；(3)數(shù)據(jù)的信息(病例組和對(duì)照組人數(shù)、病例組和對(duì)照組的各基因型和等位基因頻數(shù)、HWE檢驗(yàn)的P值等)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將所納入的數(shù)據(jù)運(yùn)用Review Manager 5.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用OR及95%CI進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用HWE確認(rèn)研究樣本的群體代表性(若P>0.05，表示研究對(duì)照組的結(jié)果符合HWE；若P<0.05，表明不符合HWE)。異質(zhì)性檢驗(yàn)采用P和I2檢驗(yàn)，若I2>50%以及P<0.05則說(shuō)明具有顯著異質(zhì)性，需采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析；若P≥0.05提示異質(zhì)性較小時(shí)則采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析，同時(shí)計(jì)算OR值和95%CI，并分析引起異質(zhì)性可能的因素。I2<25%，25%≤I2<50%，I2≥50%，分別表示低度、中度和高度異質(zhì)性。最后通過(guò)egger’s檢驗(yàn)和漏斗圖評(píng)估本項(xiàng)研究是否存在發(fā)表偏倚。

結(jié) 果

一、納入文獻(xiàn)基本情況

按檢索策略，初步檢索到相關(guān)文獻(xiàn)95篇，按剔除標(biāo)準(zhǔn)剔除82篇，得到13篇，通讀全文后排除5篇，再根據(jù)是否符合HWE檢驗(yàn)又剔除1篇[8]，最終納入7篇文獻(xiàn)[9-15](圖1)。發(fā)表年份為2007～2019年，研究人群為亞洲人和高加索人。所有研究中對(duì)照組基因型分布均符合HWE平衡?；蚍中偷姆椒镻CR-RFLP。各項(xiàng)研究病例組均已排除具有導(dǎo)致精子發(fā)生障礙的原因，精液檢查為無(wú)精子癥或嚴(yán)重少精子癥不育男性；對(duì)照組為正常的健康男性(表1)。

圖1 文獻(xiàn)的納入與排除過(guò)程

表1 Meta分析中7篇文獻(xiàn) XRCC1 rs25487基因型的主要特征

二、Meta分析結(jié)果

1. 等位基因模型與男性不育的Meta分析：結(jié)果顯示，等位基因模型A vs. G：OR=1.06，95%CI(0.83，1.36)，P=0.64。提示在等位基因模型中XRCC1 rs25487與男性不育發(fā)生無(wú)明顯相關(guān)性(圖2)。

圖2 等位基因模型與男性不育的Meta分析(A vs. G)

2. 顯性模型與男性不育的Meta分析：結(jié)果顯示，顯性模型AA+AG vs. GG：OR=1.08，95%CI(0.76，1.54)，P=0.67。提示在顯性模型中XRCC1 rs25487與男性不育發(fā)生無(wú)明顯相關(guān)性(圖3)。

圖3 顯性模型與男性不育的Meta分析(AA+AG vs. GG)

3.隱性模型與男性不育的Meta分析：結(jié)果顯示，隱性模型AA vs. GG+AG：OR=1.03，95%CI(0.77，1.36)，P=0.85。提示在隱性模型中XRCC1 rs25487與男性不育發(fā)生無(wú)明顯相關(guān)性(圖4)。

圖4 隱性模型與男性不育的Meta分析(AA vs. GG+AG)

4.純合模型與男性不育的Meta分析：結(jié)果顯示，純合模型AA vs. GG：OR=1.03，95%CI(0.77，1.36)，P=0.85。提示在純合模型中XRCC1 rs25487與男性不育發(fā)生無(wú)明顯相關(guān)性(圖5)。

圖5 純合模型與男性s不育的Meta分析(AA vs. GG)

5.雜合模型與男性不育的Meta分析：結(jié)果顯示，雜合模型AG vs. GG：OR=1.04，95%CI(0.72，1.51)，P=0.82。提示在雜合模型中XRCC1 rs25487與男性不育發(fā)生無(wú)明顯相關(guān)性(圖6)。

圖6 雜合模型與男性不育的Meta分析(AG vs. GG)

6.分層分析XRCC1 rs25487多態(tài)性與男性不育發(fā)生之間的危險(xiǎn)因素：根據(jù)種族和病例數(shù)(>200和<200)不同進(jìn)一步分層分析，在5種比較模型中，結(jié)果顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明種族和病例數(shù)不是XRCC1 rs25487多態(tài)性與男性不育發(fā)生之間的危險(xiǎn)因素(表2)。

表2 XRCC1 rs25487在5種比較模型中的結(jié)果

三、敏感性和發(fā)表偏倚分析

將5種基因型模型中的單個(gè)研究逐個(gè)剔除后重新獲得其他研究合并的OR值及95%CI，結(jié)果顯示剔除單個(gè)研究后Meta分析結(jié)果均未發(fā)生顯著變化，可以判定最終的合并效應(yīng)量較穩(wěn)定。但在剔除Garcia-Rodriguez(2018)等[10]、Gu(2007)等[11]兩篇文獻(xiàn)后5種模型比較中的異質(zhì)性均有不同程度的降低，并且結(jié)果顯示在等位基因模型中A vs. G：OR=1.23，95%CI(1.05，1.43)(P=0.009)，說(shuō)明這兩篇文章是異質(zhì)性的主要來(lái)源(表3)。采用egger’s檢驗(yàn)和繪制漏斗圖形，結(jié)果顯示等位基因模型、顯性模型、隱性模型、純合模型和雜合模型的漏斗圖基本對(duì)稱，沒(méi)有明顯的發(fā)表偏倚情況(圖7)。

表3 XRCC1 rs25487在5種比較模型中調(diào)整后的結(jié)果

圖7 XRCC1 rs25487在5種比較模型中的Meta分析漏斗圖

討 論

男性不育的發(fā)生受多種因素的干擾，而遺傳因素占主導(dǎo)地位，其中精子的發(fā)生最為關(guān)鍵。精子的產(chǎn)生是一個(gè)多步驟、多條件、多階段的過(guò)程。生精細(xì)胞如持續(xù)受到內(nèi)源性物質(zhì)(如活性氧等)和外源性物質(zhì)(例如射線、化學(xué)毒物等)影響，會(huì)導(dǎo)致大量DNA受損，繼而造成男性生育功能障礙[16]。因此，通過(guò)DNA修復(fù)維持精子DNA的完整性是男性正常生育的一項(xiàng)重要環(huán)節(jié)。XRCC1基因在BER修復(fù)途徑中起重要作用，其作為連接體與DNA聚酶β、 DNA連接酶Ⅲ、多聚ADP核糖聚合酶以及多核苷酸激酶等結(jié)合，通過(guò)一系列反應(yīng)形成DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，參與各種損傷造成的堿基切除修復(fù)和單鏈斷裂修復(fù)[17-18]。DNA修復(fù)能力減弱可能會(huì)增加生殖細(xì)胞及生精相關(guān)基因的突變風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步導(dǎo)致精子發(fā)生的失敗，引起精子減少甚至出現(xiàn)無(wú)精子癥[19]。從2007年開(kāi)始，一些病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)XRCC1基因多態(tài)性可能會(huì)增加男性不育的風(fēng)險(xiǎn)[11]。近年來(lái)，關(guān)于XRCC1基因多態(tài)性rs25487與男性不育發(fā)生的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)研究有很多，但結(jié)果存在較大的爭(zhēng)議。本文所納入的7篇文獻(xiàn)中，Garcia-Rodriguez等[10]、Gu等[11]、Zheng等[13]、姚佳欣等[14]和張健等[15]的研究結(jié)果認(rèn)為XRCC1 rs25487基因多態(tài)性與男性不育有相關(guān)性，而Akbas等[9]和Ji等[12]的研究結(jié)論認(rèn)為沒(méi)有相關(guān)性。后來(lái)，Singh等[20]的研究也發(fā)現(xiàn)XRCC1 rs25487與男性不育無(wú)相關(guān)性?？梢?jiàn)不同的研究由于研究背景及人群的不同結(jié)果也會(huì)有所差異。因此，本研究運(yùn)用Meta分析方法對(duì)所納入的既往文獻(xiàn)進(jìn)行整理綜合統(tǒng)計(jì)，以期得到更為客觀、真實(shí)的評(píng)價(jià)結(jié)果用于指導(dǎo)臨床和實(shí)驗(yàn)研究。

本研究共納入7篇病例對(duì)照試驗(yàn)，其中病例組1 579例，對(duì)照組1 013例。對(duì)各項(xiàng)納入研究進(jìn)行HWE檢驗(yàn)，均符合平衡(P>0.05)。整體分析顯示，在5種比較模型中，XRCC1 rs25487多態(tài)性與男性不育發(fā)生之間無(wú)相關(guān)性。異質(zhì)性檢驗(yàn)提示各項(xiàng)研究均存在中、高度異質(zhì)性，當(dāng)去除Garcia-Rodriguez(2018)等[10]，Gu(2007)等[11]兩篇文獻(xiàn)后，5種模型比較中的異質(zhì)性均有不同程度的降低，說(shuō)明這兩篇文獻(xiàn)是主要異質(zhì)性的來(lái)源。我們根據(jù)種族和病例數(shù)(>200和<200)不同進(jìn)一步分層分析顯示，亞組分析結(jié)果顯示差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。發(fā)表偏倚情況采用egger’s檢驗(yàn)和繪制漏斗圖形，未發(fā)現(xiàn)明顯的發(fā)表偏倚，證明研究結(jié)論可靠。

本次Meta分析雖然按照嚴(yán)格納入標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)篩選過(guò)程進(jìn)行，但仍存在一些不足。首先，文獻(xiàn)納入數(shù)量較少，僅有7篇，數(shù)據(jù)分析結(jié)果存在一定偶然性誤差；其次，納入人群僅為亞洲人和高加索人，由于不同種族的生活習(xí)俗、遺傳背景及飲食習(xí)慣的差異可能對(duì)本結(jié)果的穩(wěn)定性產(chǎn)生干擾；最后，部分患者的詳細(xì)信息(生活習(xí)俗、工作狀態(tài)、身體狀況及家族病史情況等)文獻(xiàn)中采集不夠準(zhǔn)確，存在一定干擾因素。因此，后續(xù)有待于臨床上開(kāi)展多中心、大樣本的高質(zhì)量病例對(duì)照或隊(duì)列研究以獲得更嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)的結(jié)論。