徐少蓉，吳延，周孟君，賴婷，李丹，馬琴芹，路巍，李俊林，何瑋，李潤，郭翠翠，張耀

(綿陽市中心醫(yī)院，綿陽 621000)

隨著現(xiàn)代社會環(huán)境的變化以及人們生活習慣的改變，不孕不育發(fā)生率逐年增加；自2016年二胎政策全面放開以來，有生育要求的高齡女性越來越多[1]。同時由于環(huán)境因素、遺傳因素、社會因素以及生活習慣和工作壓力等諸多因素的影響，卵巢儲備功能減退(DOR)患者的比例越來越高，在接受輔助生殖技術(ART)的不孕患者中約占10%[2]。高齡和DOR患者在體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)助孕時常表現(xiàn)為卵巢低反應(POR)，控制性促排卵(COS)過程中容易出現(xiàn)促性腺激素(Gn)用量大、發(fā)育的卵泡少、獲卵數(shù)少的現(xiàn)象，導致臨床妊娠率降低、周期取消率升高[3]。為了有效解決上述問題，生殖領域醫(yī)生進行了許多嘗試，比如應用不同的降調(diào)節(jié)方案、給予不同的促排卵藥物劑量、添加雄激素[如脫氫表雄酮(DHEA)]或者小劑量的生長激素(GH)以及采用中醫(yī)藥治療等，但目前仍沒有針對POR患者最佳助孕方案的臨床指南和共識，如何為這類患者選擇合適有效的COS方案，改善其促排卵結局，最終提高其臨床妊娠率，是目前輔助生殖領域的研究熱點和難點之一。

近年來Kuang等[4]進行黃體期促排卵，未發(fā)生早發(fā)LH峰，并且獲得了理想的妊娠結局；該團隊繼續(xù)對卵巢儲備功能正常的不孕癥患者采用高孕激素狀態(tài)下促排卵方案(PPOS方案)發(fā)現(xiàn)，PPOS方案可以有效抑制早發(fā)LH峰，獲得理想的妊娠結局[5]。目前已有諸多研究證實PPOS方案應用于POR、卵巢反應正常以及高反應人群，均能有效抑制早發(fā)LH峰并獲得較理想的臨床結局[6-12]，尤其在POR患者中更具優(yōu)勢，但該觀點尚缺乏大樣本多中心研究支持，且PPOS方案在各生殖中心的臨床應用尚不廣泛，其衛(wèi)生經(jīng)濟學效益等仍有待進一步研究。因此，本研究采用前瞻性研究的方法，對POR患者分別應用PPOS方案與微刺激方案促排卵，比較兩種方案的促排卵結局和胚胎實驗室指標，旨在探討PPOS方案應用于POR患者的臨床價值。

資料與方法

一、研究對象

收集2017年9月至2019年12月在我院生殖醫(yī)學中心接受IVF/ICSI-ET助孕治療的POR患者的臨床資料(共74個周期)。納入標準：符合2011年歐洲人類胚胎與生殖學會(ESHER)和美國生殖醫(yī)學協(xié)會(ASRM)在意大利博洛尼亞討論并制定的POR診斷共識[13]：(1)年齡≥40歲或存在卵巢反應不良的其它危險因素；(2)前次IVF周期出現(xiàn)POR，常規(guī)促排卵方案獲卵數(shù)≤3個；(3)卵巢儲備功能下降：基礎竇卵泡數(shù)(AFC)<5～7個或抗苗勒管激素(AMH)<0.5～1.1 mg/L；如果年齡<40歲或卵巢儲備功能檢測正常，患者連續(xù)2個周期應用最大化的卵巢刺激方案仍出現(xiàn)POR也可診斷；至少滿足以上3條中的2條即可診斷為POR。所有患者均符合《人類輔助生殖技術規(guī)范》的適應證并排除禁忌證。排除標準：(1)夫妻任何一方患有嚴重的精神疾患、泌尿生殖系統(tǒng)急性感染、性傳播疾??；(2)患有《母嬰保健法》規(guī)定的不宜生育、目前無法進行產(chǎn)前診斷或胚胎植入前遺傳學診斷(PGD)的遺傳性疾病；(3)夫妻任何一方有吸毒等嚴重不良嗜好；(4)夫妻任何一方接觸致畸量的射線、毒物、藥品并處于作用期；(5)女方子宮不具備妊娠功能或患有嚴重軀體疾病不能承受妊娠。

本研究所有納入的患者由同一高年資醫(yī)師進行溝通，患者在充分知情理解后自愿選擇PPOS方案或微刺激方案，并簽署治療同意書。本研究取得我院生殖醫(yī)學倫理委員會審核同意。

按照COS方案不同將研究對象分為兩組：PPOS組(55個周期)和微刺激組(19個周期)。

二、研究方法

1.COS方案：(1)PPOS方案：在月經(jīng)周期第2～3天開始給予安宮黃體酮(浙江仙琚制藥)10 mg/d至扳機日，同時根據(jù)患者年齡、體重指數(shù)(BMI)、AFC、AMH、基礎FSH(bFSH)、bFSH/bLH比值和既往促排卵卵巢反應情況，開始使用麗申寶(珠海麗珠制藥)和/或HMG(珠海麗珠制藥)150～300 U/d，促排治療4 d后行陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，同時監(jiān)測血清FSH、LH、E2、P水平，并根據(jù)血清性激素水平和卵泡發(fā)育情況調(diào)整促排卵藥物的劑量。(2)微刺激方案：在月經(jīng)周期第2～3天開始給予克羅米芬(高特制藥，塞浦路斯)50～100 mg或來曲唑(江蘇恒瑞醫(yī)藥)2.5～5.0 mg口服5 d，5 d后行陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，同時監(jiān)測血清性激素水平，并根據(jù)血清性激素水平和卵泡發(fā)育情況增加或不增加麗申寶和/或HMG 150～300 U/d，如血清LH水平超過bLH水平2倍以上，或卵泡直徑≥14 mm，則皮下注射促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRH-ant，默沙東，美國)抑制早發(fā)LH峰。

兩組患者中當有1個以上直徑≥20 mm的卵泡或者3個以上直徑≥18 mm的卵泡時，當晚給予重組人絨毛膜促性腺激素(rHCG，艾澤，默克雪蘭諾，意大利)250 μg扳機，36 h后取卵。

2.取卵及IVF：在陰道超聲引導下行取卵術，依次抽吸所有直徑10 mm以上的卵泡。IVF方式根據(jù)男方精液情況和既往受精情況評估決定，行常規(guī)IVF或ICSI受精。按照本中心常規(guī)操作進行胚胎培養(yǎng)，并根據(jù)胚胎發(fā)育過程中卵裂球大小、形態(tài)及碎片比例等指標將卵裂期胚胎分為Ⅰ～Ⅳ級[14]：Ⅰ級胚胎：卵裂球大小均勻，形狀規(guī)則，透明帶完整；胞質(zhì)均質(zhì)、清晰；胚胎內(nèi)碎片≤5%。Ⅱ級胚胎：卵裂球大小略不均勻，形狀略不規(guī)則；胞質(zhì)均勻或存在少量空泡；碎片6～20%。Ⅲ級胚胎：卵裂球大小明顯不均勻，可有明顯的形狀不規(guī)則；胞質(zhì)可有明顯顆?；虼罅靠张?；碎片20～50%。Ⅳ級胚胎：細胞大小嚴重不均勻；胞質(zhì)可有嚴重顆粒現(xiàn)象，變黑，或有大量空泡；碎片超過50%。將來源于正常受精卵，且受精后第3天胚胎細胞數(shù)7～9個，評分為Ⅰ～Ⅱ級的胚胎定義為D3優(yōu)質(zhì)胚胎；將來源于0PN、1PN、2PN的受精卵，受精后D3胚胎細胞數(shù)4～11個，評分為Ⅰ～Ⅲ級的胚胎定義為D3可利用胚胎。

因PPOS方案與微刺激方案均影響子宮內(nèi)膜容受性，故全部取消新鮮周期移植，行全胚胎冷凍，擇期行凍融胚胎移植(FET)。

3. FET及妊娠判斷：所有解凍周期患者均選擇激素替代治療(HRT)準備內(nèi)膜，于月經(jīng)周期第3天起，口服天然雌激素，起始劑量4 mg/d，每4 d增加劑量2 mg/d，至8 mg/d，通常雌激素使用時間≥12 d。當子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm時，參考當日血清E2、P水平，給予黃體酮注射液(浙江仙琚制藥)60 mg/d或黃體酮陰道緩釋凝膠(默克雪蘭諾，美國)90 mg/d。孕激素用藥第4日移植D3胚胎，第6日移植D5/D6囊胚，移植后繼續(xù)使用雌孕激素，可添加地屈孕酮(雅培，荷蘭)20 mg/d，行黃體支持至孕12周。移植后12/14日測血β-HCG值≥25 U/L確定生化妊娠，移植后28/30日B超見孕囊者確定為臨床妊娠。

4.觀察指標：主要評價指標有：早發(fā)LH峰發(fā)生情況、獲卵數(shù)、MⅡ卵率、正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可利用胚胎率等。早發(fā)LH峰指扳機前LH>10 U/L。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、兩組患者一般資料比較

經(jīng)Mann-WhitneyU檢驗顯示，PPOS組和微刺激組患者的年齡、不孕年限、BMI、AMH、AFC、bFSH、bLH、bE2等比較均無顯著性差異(P>0.05)，提示兩組患者具有可比性(表1)。

表1 兩組患者一般情況比較[M(P25，P75)]

二、兩組患者促排卵情況比較

經(jīng)Mann-WhitneyU檢驗顯示，PPOS組的Gn天數(shù)、Gn總量、HCG日E2水平、HCG日≥14 mm卵泡數(shù)顯著高于微刺激組(P<0.05)；PPOS組HCG日LH水平顯著低于微刺激組(P<0.05)；兩組HCG日P水平比較無顯著性差異(P>0.05)(表2)。PPOS組無早發(fā)LH峰出現(xiàn)，微刺激組發(fā)生2例早發(fā)LH峰。

三、兩組患者胚胎實驗室指標比較

PPOS組獲卵數(shù)顯著高于微刺激組(3.0 vs. 2.0)(P<0.05)；PPOS組與微刺激組的MⅡ卵率(94.6% vs. 95.5%)、正常受精率(67.7% vs. 64.3%)、卵裂率(97.0% vs. 97.4%)、優(yōu)質(zhì)胚胎率(46.8% vs. 29.6%)、可利用胚胎率(69.8% vs. 52.6%)比較均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表2 兩組患者促排卵情況比較[M(P25，P75)]

表3 兩組患者胚胎實驗室指標比較[M(P25，P75)，%]

四、兩組患者臨床妊娠情況

PPOS組行HRT-FET共37個周期，臨床妊娠6例，其中宮內(nèi)單胎5例，宮內(nèi)雙胎1例，活產(chǎn)1例健康男嬰，其余5例至文章撰寫時尚未分娩；微刺激組行HRT-FET共11個周期，臨床妊娠3例，全是宮內(nèi)單胎，至文章撰寫時尚未分娩。因樣本量少，且至撰文時微刺激組尚未有妊娠結局，因此未對兩組的妊娠結局進行統(tǒng)計學分析。

討 論

POR在人群中的發(fā)病率越來越高，尤其在≥40歲的高齡女性中發(fā)生率超過50%[15]，POR患者在助孕過程中對Gn反應差，用藥劑量大，獲卵少，胚胎質(zhì)量差，促排卵效果不理想，難以獲得理想的妊娠結局[16]。目前在臨床工作中，微刺激方案、拮抗劑方案、自然周期和短效長方案等均有應用于POR患者，但降調(diào)節(jié)方案可能導致卵巢過度抑制，導致Gn用量大、用藥時間長，藥物耗費高，用藥復雜等現(xiàn)象。自然周期、微刺激方案以及拮抗劑方案雖然簡單，但無法完全避免早發(fā)LH峰導致的周期取消，卵泡早期LH升高還可能會對卵子質(zhì)量產(chǎn)生負面影響[17]。因此尋找合適的COS方案，盡快獲取高質(zhì)量的卵子和胚胎，是改善POR患者臨床結局的關鍵。本研究分析了POR患者使用PPOS方案(55個周期)的臨床療效，研究結果顯示PPOS方案可以明顯改善卵巢的反應性，同時有效抑制早發(fā)LH峰，不失為POR患者的一種可選促排卵方案。PPOS方案的有效機制是在雌激素水平上升前給予孕激素，使下丘腦孕激素化，以阻斷雌激素誘導的正反饋作用，抑制早發(fā)LH峰的發(fā)生；且該方案不干擾下丘腦GnRH受體功能，并不抑制垂體Gn的脈沖式分泌。同時，孕激素具有拮抗雌激素的作用，該作用對于臨床常見的雌激素依賴性疾病(如子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤等)具有一定的緩解作用[18]。

PPOS方案臨床運用的有效性已被較多研究證實。張欣等[6]研究顯示PPOS方案在高齡患者中能顯著提高卵母細胞受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率。沈秀等[7]將PPOS方案應用于FSH升高的DOR患者，發(fā)現(xiàn)其能有效抑制LH峰，提高優(yōu)質(zhì)胚胎率。葉靜等[8]在卵巢功能正?；颊咧袘肞POS方案，發(fā)現(xiàn)其獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、可利用胚胎數(shù)及隨后FET周期中的臨床妊娠率等均與短方案相似。楊菁等[9]發(fā)現(xiàn)PPOS方案在POR患者中能較好地抑制早發(fā)LH峰，增加可移植胚胎率。郭麗娜等[10]對長方案促排后助孕未獲成功的卵巢正常反應患者應用PPOS方案發(fā)現(xiàn)，PPOS方案可以改善胚胎質(zhì)量，獲得較好的臨床妊娠結局。顏曉紅等[11]認為PPOS方案不僅經(jīng)濟簡便，且其應用于POR患者可以有效抑制早發(fā)LH峰，獲得滿意的胚胎質(zhì)量。本研究中，PPOS方案的獲卵數(shù)顯著優(yōu)于微刺激方案，證明PPOS方案能改善POR患者的卵巢反應性。PPOS組患者均無早發(fā)LH峰出現(xiàn)，微刺激組2例患者出現(xiàn)早發(fā)LH峰，證明PPOS方案能有效抑制早發(fā)LH峰。兩組方案的MⅡ卵率、正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率等比較均無顯著性差異。

PPOS方案持續(xù)應用外源性孕激素是否會對卵子質(zhì)量造成影響進而威脅子代安全，是生殖醫(yī)師關注的重點。Venetis等[19]對60 000多個促排卵周期的資料行Meta分析表明，高孕激素水平主要影響本次促排周期的子宮內(nèi)膜容受性，對卵泡發(fā)育和胚胎質(zhì)量并無明顯影響。Zhang等[20]對PPOS方案促排卵獲得的新生兒(n=1 931)隨訪后觀察到，與傳統(tǒng)的短方案(n=1 658)和微刺激方案(n=1 007)相比，PPOS方案促排卵后獲得的新生兒在不良出生結局和畸形率等方面的風險并沒有增加。Chen等[21]回顧性分析587例新生兒的出生缺陷發(fā)生情況，證明了黃體期促排卵的子代安全性，而PPOS方案與黃體期促排卵方案均是高孕激素狀態(tài)下促排卵，且PPOS方案更接近生理性卵泡生長。但因為本研究樣本量有限，還有一部分患者的胚胎未移植，移植并妊娠的患者中僅PPOS組分娩1例健康男嬰，微刺激方案中獲得臨床妊娠的患者至撰文時尚未分娩，故本研究無法驗證PPOS方案的子代健康問題。

近年來隨著FET技術的不斷成熟，凍融胚胎復蘇率逐年升高，提示凍融胚胎的質(zhì)量及發(fā)育潛力未受到明顯影響。國內(nèi)外多項研究證實了FET技術的安全性[22-25]，為PPOS方案全胚冷凍提供了技術支持?？傊?，PPOS方案作為一種新型、簡單、經(jīng)濟、有效的方案，簡化了促排卵過程，且能有效抑制早發(fā)LH峰，降低周期取消率，改善卵巢反應性，是一種適合POR患者的臨床促排卵方案，但仍需多中心大樣本的臨床研究進一步觀察驗證，以期不斷完善和優(yōu)化PPOS方案，使其更好地應用于臨床治療。