丹尼爾·多里坤， 伊地力斯·阿吾提， 卡吾力·居買， 楊 寧， 張力為， 買地尼也提·尼亞孜

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1臨床醫(yī)學(xué)研究院； 2胸外科， 烏魯木齊 830054)

食管癌是一種常見的消化道腫瘤，我國食管癌的發(fā)病率和死亡率居世界第一[1-3]，新疆是我國食管癌的集中高發(fā)區(qū)[4,5]。目前臨床上對食管癌的治療方法包括手術(shù)或放療為主、化療為輔的治療模式，但患者預(yù)后較差，尤其是晚期食管癌，患者總體5年生存率僅為8～25%[6,7]。近年來隨著分子腫瘤學(xué)的發(fā)展，分子靶向治療為食管癌的治療提供了另一種的有效途徑，分子靶向治療是以腫瘤細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療方法，目前在部分惡性腫瘤治療中替代了一線化療[8-11]。在多種腫瘤中均可以觀察到表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)的過表達(dá)，有時(shí)伴有基因擴(kuò)增，因此EGFR是目前主要的腫瘤治療靶點(diǎn)[12-13]。靶向治療的一個(gè)關(guān)鍵問題就是找到最佳的治療對象，熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)檢測基因擴(kuò)增為篩選靶向藥物的適用者提供了新的途徑[14]。本研究采用免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry, IHC)結(jié)合FISH技術(shù)確定食管癌EGFR表達(dá)和基因擴(kuò)增情況，探究蛋白表達(dá)與基因擴(kuò)增的關(guān)系，進(jìn)一步分析 EGFR基因與腫瘤的臨床病理特征以及預(yù)后的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2009年11月-2012年12月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科收治的71例食管癌患者癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本，均為鱗狀細(xì)胞癌。其中男性52例，女性19例，年齡38～79歲，中位年齡58歲。根據(jù)AJCC癌癥分期手冊進(jìn)行術(shù)后病理學(xué)分期[15]。細(xì)胞分化程度：高分化23例，中分化28例，低分化20例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例。腫瘤T分期:T1期 4例,T2 期30例,T3 期33例，T4 期4例。本研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，對患者和家屬介紹研究意義得到同意后均簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學(xué)方法采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法。EGFR 兔抗多克隆抗體購自美國Abcam 公司，測定步驟按試劑盒說明書操作:常規(guī)脫蠟水化，用3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，經(jīng)高壓加熱法抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清工作液孵育30 min，滴加EGFR抗體(1∶100) 4℃放置過夜,用PBS 沖洗，滴加二抗后，置于恒溫箱37℃下孵育30 min，用PBS 沖洗，經(jīng)DAB顯色，用蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，封片。以0.01 mol/L PBS液替代一抗作陰性對照。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷免疫組織化學(xué)結(jié)果采取雙盲法觀察切片并診斷，使用細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分法及陽性細(xì)胞面積率計(jì)分法比較蛋白表達(dá)水平差異[16]。EGFR的陽性細(xì)胞染色定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，以淺黃、棕黃或更深的棕褐色的細(xì)小顆粒作為陽性細(xì)胞。依照細(xì)胞陽性著色程度，可分為無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。光鏡下每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×20)，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分比，0%為0分， 1%～25%為1分， 26%-～50%為2分， 51%～75%為3分，>75%為4分。細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分與陽性面積率計(jì)分之積為最后分：0分：(-)，1～2分：(+)，3～4分：(2+)，>4分：(3+)。

1.4 EGFR擴(kuò)增情況的測定采用FISH技術(shù)檢測食管癌組織標(biāo)本中EGFR基因擴(kuò)增，用橘紅色熒光標(biāo)記EGFR基因，綠色熒光標(biāo)記7號(hào)染色體著絲粒區(qū)域。標(biāo)本用(73±1)℃的甲酰胺液(70%甲酰胺液：20×SSC溶液4 mL, 甲酰胺28 mL，蒸餾水8 mL)分解變性處理2 min后，依次置于70%、85%和100%的乙醇中各2 min進(jìn)行梯度脫水。玻片干燥后，置于45℃電熱板上預(yù)熱5 min,用(73±1)℃恒溫水浴槽中加熱5 min的探針吸取10 μL滴于切片雜交區(qū)域放入濕盒，在37℃恒溫孵育箱中雜交16 h，用(73±1)℃的2×SSC溶液洗滌2 min，再放入同樣緩沖液在室溫下洗滌1 min。用DAPI II復(fù)染液復(fù)染，封片，用熒光顯微鏡和激光共聚焦儀測定。

1.5 FISH陽性判別標(biāo)準(zhǔn)[17](1)≥4個(gè)紅色信號(hào)的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的40%以上；(2)統(tǒng)計(jì)Ratio值，若Ratio>2為陽性結(jié)果(Ratio值=100個(gè)細(xì)胞核中紅信號(hào)總數(shù)/100個(gè)細(xì)胞核中綠信號(hào)總數(shù))；(3)≥15個(gè)紅色信號(hào)的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的10%以上；(4)成簇?cái)U(kuò)增的細(xì)胞≥10%以上。以上均為陽性結(jié)果，提示樣本中EGFR基因發(fā)生擴(kuò)增。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用非參數(shù)獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，兩個(gè)指標(biāo)間的比較采用卡方檢驗(yàn)。單因素分析采用Kaplan-Meier 法，多因素分析采用COX回歸模型，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EGFR蛋白表達(dá)的免疫組化分析EGFR陽性細(xì)胞染色定位于腫瘤細(xì)胞膜以及細(xì)胞質(zhì)，癌旁正常食管粘膜上皮( 距腫瘤邊緣>5 cm ) 僅見上皮基底細(xì)胞低水平染色(+/-)，基底以上的上皮細(xì)胞均呈 EGFR 陰性表達(dá)(圖1, B)。71例食管癌患者中 51 例(71.83%)發(fā)現(xiàn)有EGFR過表達(dá)，其中 29 例為 3+，22 例為 2+，判定為陽性；12 例(16.9%)呈現(xiàn)較弱(1+)的免疫反應(yīng)，判定陰性；8 例(11.26%)沒有檢測到 EGFR 表達(dá)。癌旁正常組織沒有檢測到 EGFR陽性表達(dá)，食管癌組織相對于癌旁正常組織，EGFR蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，見圖1。

圖1 EGFR 蛋白表達(dá)的免疫組化分析

2.2 EGFR 蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系不同性別組、不同年齡組、不同腫瘤分化程度組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無組以及不同浸潤深度組之間比較，EGFR蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 食管癌患者不同臨床病理因素條件下EGFR蛋白表達(dá)狀態(tài)

2.3 EGFR FISH檢測結(jié)果正常上皮細(xì)胞和非腫瘤基質(zhì)或炎癥細(xì)胞呈2個(gè)紅色信號(hào)(EGFR基因)和2個(gè)綠色信號(hào)(7號(hào)染色體著絲粒)。被檢測的40例食管癌中17例(42.5%)有EGFR基因擴(kuò)增, 10%以上的腫瘤細(xì)胞可見15個(gè)以上的紅色信號(hào)和2個(gè)以上綠色信號(hào)的成簇?cái)U(kuò)增(圖2，A),40%以上的腫瘤細(xì)胞內(nèi)可見4個(gè)或更多的紅色和綠色信號(hào)的多倍體擴(kuò)增(圖 2，B)。

圖2 EGFR 基因擴(kuò)增FISH圖

2.4 EGFR 基因擴(kuò)增與臨床病理因素的關(guān)系不同性別、不同年齡、不同浸潤深度患者之間比較，EGFR 基因擴(kuò)增差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同腫瘤分化程度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者之間比較，EGFR 基因擴(kuò)增差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 食管癌 EGFR 基因擴(kuò)增情況與臨床病理因素的關(guān)系

2.5 食管癌 EGFR 基因擴(kuò)增與蛋白表達(dá)的相關(guān)性EGFR蛋白表達(dá)與基因擴(kuò)增相關(guān)，尤其是高表達(dá)(2/3+)與基因擴(kuò)增密切相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表3 食管癌 EGFR蛋白表達(dá)與基因擴(kuò)增的相關(guān)性

2.6EGFR基因擴(kuò)增與食管癌預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier單因素分析顯示，EGFR蛋白表達(dá)陰性及陽性組，中位生存時(shí)間(95%CI)分別是21個(gè)月(10.999～31.001)和16個(gè)月(12.984～19.016),見表4。兩組患者生存曲線如圖3所示，EGFR蛋白不同表達(dá)與患者生存率無關(guān)(P>0.05)。EGFR基因擴(kuò)增陰性和陽性組，中位生存時(shí)間(95%CI)分別是27個(gè)月(21.181～32.819)和17個(gè)月(13.425～20.575)。兩組患者生存曲線如圖4所示，EGFR不同擴(kuò)增狀態(tài)與患者生存率相關(guān)，即EGFR擴(kuò)增陽性患者生存期較擴(kuò)增陰性患者顯著要長(P<0.05)。進(jìn)一步多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，EGFR基因擴(kuò)增是食管鱗癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表5。

表4 EGFR蛋白表達(dá)及基因擴(kuò)增對食管癌患者預(yù)后影響的單因素分析

圖3 EGFR蛋白表達(dá)生存曲線圖

圖4 EGFR基因擴(kuò)增生存曲線圖

表5 EGFR蛋白表達(dá)及基因擴(kuò)增對食管癌患者預(yù)后影響的多因素分析

3 討論

目前手術(shù)切除仍是食管癌的主要治療方法，由于早期癥狀不典型，患者就診時(shí)多半已屬中晚期或轉(zhuǎn)移無法根治切除[18]，食管癌是一種侵襲力較強(qiáng)的惡性腫瘤，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是預(yù)后差的另一主要原因[19]。因此改善患者預(yù)后、延長生存期和改善生存質(zhì)量成為食管癌治療的關(guān)鍵。原癌基因EGFR在食管癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，EGFR被異?；罨螅ㄟ^作用于細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控以及血管生成而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和增殖。Mimura等[20]報(bào)道EGFR 抑制劑能明顯抑制 EGFR 及Her-2 過表達(dá)，從而抑制食管癌細(xì)胞系的增殖。本研究中71.83% 的食管癌患者病例檢測到 EGFR 蛋白過表達(dá)，結(jié)果與惠州客家人群食管癌[21]以及Carneiro等[22]報(bào)道的結(jié)果相近。Gibault等[23]發(fā)現(xiàn)EGFR過度表達(dá)與脈管侵犯、局部復(fù)發(fā)和較低的生存率顯著相關(guān)，另有研究發(fā)現(xiàn)EGFR的過表達(dá)率與食管癌的預(yù)后因素沒有關(guān)聯(lián)[24]。本研究發(fā)現(xiàn) EGFR 過表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度等預(yù)后因素沒有相關(guān)性，與Gotoh等[24]研究結(jié)果一致 。本研究中低分化食管癌EGFR表達(dá)以強(qiáng)陽性(3+)為主，而高分化食管癌 EGFR 以中等度或弱陽性(2+～+)為主，雖然沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是提示EGFR過表達(dá)與食管癌惡性表型有關(guān)。

腫瘤組織中可以觀察到EGFR 過表達(dá)，其原因是基因擴(kuò)增[25-27]，隨著FISH技術(shù)發(fā)展，該方法在肺癌等腫瘤中已成為檢測EGFR基因擴(kuò)增的金標(biāo)準(zhǔn)[28]。本研究同時(shí)采用FISH技術(shù)檢測食管癌組織EGFR基因擴(kuò)增情況，發(fā)現(xiàn)EGFR蛋白表達(dá)與基因擴(kuò)增相關(guān)，尤其是高表達(dá)(2/3+)與基因擴(kuò)增密切相關(guān)，與Hanawa等[25]報(bào)告的研究結(jié)果相似。EGFR 基因擴(kuò)增的患者生存時(shí)間小于EGFR無擴(kuò)增的患者，這也進(jìn)一步證明EGFR基因擴(kuò)增是一個(gè)有價(jià)值的預(yù)后預(yù)測因子[29]。

綜上所述，EGFR基因可能參與了食管癌的發(fā)生，在腫瘤進(jìn)展、預(yù)后等方面也有一定的作用。EGFR蛋白表達(dá)及基因擴(kuò)增的聯(lián)合檢測可作為判斷食管癌預(yù)后和指導(dǎo)靶向藥物治療的重要指標(biāo)。