袁源亮， 劉 凱， 馮亞寧， 王若崢

(新疆醫(yī)科大學1第三臨床醫(yī)學院，2附屬腫瘤醫(yī)院放療中心， 烏魯木齊 830011； 3新疆腫瘤學重點實驗室， 烏魯木齊 830011；4中國醫(yī)學科學院腫瘤免疫與放療研究重點實驗室， 烏魯木齊 830011)

宮頸癌(cervical cancer, CC)如今仍然是婦女最常見的癌癥之一，根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)的數(shù)據(jù)，其發(fā)病率和死亡率都排在第四位[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)宮頸癌病例是由人乳頭瘤病毒(HPV)引起[3]。在現(xiàn)有的新療法中，免疫療法為復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性宮頸癌的婦女帶來了希望[4]。如今，越來越多的腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen, TAA)被發(fā)現(xiàn)，其中CTA被認為是癌癥免疫治療的良好候選靶點，因為它們的特點是在正常的細胞中有限制表達，同時在多數(shù)實體腫瘤中有過表達[5]。NY-ESO-1在CTA家族成員中免疫原性較強，能夠誘導特異性T細胞免疫反應(yīng)，由于它在腫瘤中的高表達并誘導相關(guān)免疫反應(yīng)，被認為是目前最有希望用于免疫干預(yù)的CTA[6-7]。ICS是用流式細胞術(shù)量化T細胞反應(yīng)性的的方法，能同時檢測單個細胞的表型及其在短期孵育過程中刺激后產(chǎn)生的細胞因子，可以進行多參數(shù)分析[8]。但是，目前對NY-ESO-1的研究在宮頸癌中鮮有報道，且尚未有使用ICS技術(shù)開展對宮頸癌的檢測。因此，本研究建立了九色流式胞內(nèi)細胞因子染色方案，同時檢測多種細胞因子，對比分析宮頸癌患者NY-ESO-1特異性T細胞免疫應(yīng)答差異及其臨床相關(guān)性，為宮頸癌的免疫治療研究的開展提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集2018年8月-2019年6月新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院收治的35例宮頸癌初治患者。納入標準：(1)首次經(jīng)病理明確診斷且未接受治療的宮頸癌初治患者；(2)KPS評分≥70分者；(3)有完整的臨床病例資料者。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤病史者；(2)急性或慢性感染性疾病者；(3)合并免疫系統(tǒng)疾病者；(4)實驗失敗者。根據(jù)納入標準及排除標準進行篩選，最終符合入組條件的宮頸癌患者31例。宮頸癌患者年齡37～83歲，中位年齡52歲；依據(jù)WHO病理分型，鱗癌29例，腺癌1例，肉瘤樣癌1例；依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2018年宮頸癌分期，I-II期15例，III-IV期16例。

1.2 材料

1.2.1 主要試劑 NY-ESO-1抗原肽由英國牛津大學MRC人類免疫學實驗室饋贈，淋巴細胞分離液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、Live/Dead染料BV510、流式細胞儀鞘液、FACS溶液、小鼠抗人單克隆抗體細胞表面標記物(CD3-BV786、CD4-PE-CY7、CD8-BB700)、細胞因子抗體(IFN-γ-AF488、TNF-α-BV650、IL-2-BV421、IL-13-APC、MIP-1β-PE)均購于BD公司。

1.2.2 主要儀器 流式細胞分析儀(BD公司)；生物安全柜(NuAire公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司)；臺式低溫離心機(Thermo Fisher公司)；96孔培養(yǎng)板(Millipore公司)。

1.3 方法

1.3.1 NY-ESO-1抗原肽體外誘導特異性T細胞 宮頸癌患者入院在未行任何治療前抽取肘靜脈血15 mL(EDTA抗凝)，用密度梯度離心法分離PBMCs。取0.4×106/L PBMCs細胞重懸于50 μL R20(含20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基)中，再加入50 μL濃度為10 μg/mL NY-ESO-1抗原肽共培養(yǎng)，37℃孵育60～90 min；用2 mL R10(含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基)清洗細胞，棄上清，重懸至含100μL H10(10%人AB血清)的96孔培養(yǎng)板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后加入100 μL含400 IU的IL-2+H10中，隔天換液1次，每次吸出培養(yǎng)上清液100 μL，再加入100 μL 200IU的IL-2+H10培養(yǎng)至10～12 d時洗滌后混勻，將細胞分為2份，每份各200 μL。

1.3.2 胞內(nèi)細胞因子染色(ICS) 培養(yǎng)至第10日，1 500 rpm/min離心5 min后棄上清，加入不含谷氨酰胺的R10洗滌并離心2次，加100 mL R20后等分為2孔，實驗孔(抗原肽刺激者，即Positive者)加入NY-ESO-1抗原肽進行刺激，對照孔(IL-2維持者，即Negative者)則加入RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后加入蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑進行阻斷，繼續(xù)孵育4 h后進行細胞表面分子染色、破膜、固定、胞內(nèi)細胞因子染色、重懸，每一步驟之間均用FACS溶液進行洗滌2次。

1.3.3 流式細胞術(shù)檢測T細胞殺傷活性 使用多色流式細胞儀BD FACS Fortessa上機分析，對所有存活的CD3+T淋巴細胞中的CD4+T和CD8+T細胞進行了門控，檢測Positive組和Negative組中所有門控T細胞中單獨或多重分泌IFN-γ、IL-2、IL-13、MIP-1β、TNF-α細胞因子產(chǎn)生細胞的百分比。采用FlowJo10.6對所得細胞亞群及細胞因子流式數(shù)據(jù)進行分析。

1.4 結(jié)果的判定標準參考本實驗之前Elispot的經(jīng)驗和國外一些細胞因子分泌判定方法[9-10]，規(guī)定對于每種細胞因子，如果Positive者-2×Negative者-0.05%≥0，則將抗原反應(yīng)性T細胞定義為陽性；而Positive者-2×Negative者-0.05%<0時將抗原反應(yīng)性T細胞定義為陰性，取值設(shè)置為0。

1.5 統(tǒng)計學分析應(yīng)用IBM SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism 8.0軟件繪制統(tǒng)計圖。計數(shù)資料使用百分比表示，NY-ESO-1抗原肽刺激的特異性T細胞免疫反應(yīng)陽性頻率與一般臨床特征間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌患者NY-ESO-1特異性T細胞免疫反應(yīng)頻率分析1例宮頸癌患者外周血中的流式細胞分析，見圖1。宮頸癌患者外周血對NY-ESO-1抗原肽刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答率為67.4%(21/31)，其中CD4+T細胞免疫應(yīng)答陽性率為32.3 %(10/31)，CD8+T細胞免疫應(yīng)答陽性率為54.8%(17/31)，見圖2。

圖1 1例宮頸癌患者外周血中CD4+、CD8+T細胞分泌細胞因子流程圖

圖2 31例宮頸癌患者NY-ESO-1特異性T細胞免疫反應(yīng)頻率

2.2 NY-ESO-1特異性T細胞分泌細胞因子模式分析宮頸癌患者外周血中CD4+和CD8+T細胞對NY-ESO-1抗原肽的5種功能反應(yīng)結(jié)果見圖3，沿著X軸列出了分泌IFN-γ+、IL-2+、IL-13+、MIP-1β+、TNF-α+的31種可能組合，紅色和藍色條分別表示宮頸癌患者31種可能組合中每種組合的CD4+和CD8+T細胞對NY-ESO-1抗原肽的反應(yīng)頻率。X軸下方的5個不同顏色的水平條表示5個、4個、3個、2個、1個功能反應(yīng)的群體。結(jié)果顯示，宮頸癌患者CD4+和CD8+T細胞反應(yīng)頻率的1個功能反應(yīng)群體明顯高于2～5個功能反應(yīng)群體。31例宮頸癌患者外周血中CD4+和CD8+T細胞分泌5種細胞因子的百分比散點圖，見圖4。

2.3 宮頸癌患者NY-ESO-1特異性T細胞免疫應(yīng)答與臨床特征宮頸癌患者無流產(chǎn)史者NY-ESO-1特異性CD4+T細胞免疫反應(yīng)陽性率明顯高于有流產(chǎn)史者，分別為63.6%、15.0%，二者差異有統(tǒng)計學意義(P=0.018)； 而在年齡、家族史、絕經(jīng)史、流產(chǎn)史、腫瘤大小、腫瘤大體類型、組織病理類型、腫瘤分化程度、FIGO分期、HPV感染、SCC、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間差異無統(tǒng)計學意義。宮頸癌患者≤52歲者NY-ESO-1特異性CD8+T細胞免疫反應(yīng)陽性率明顯高于>52歲者，分別為70.6%、35.7%，二者統(tǒng)計學差異為臨界值(P=0.052)；而在家族史、絕經(jīng)史、流產(chǎn)史、腫瘤大小、腫瘤大體類型、組織病理類型、腫瘤分化程度、FIGO分期、HPV感染、SCC、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

圖3 宮頸癌患者外周血中T細胞的5種功能反應(yīng)結(jié)果

圖4 特異性T細胞反應(yīng)分泌細胞因子概況

表1 宮頸癌NY-ESO-1特異性T細胞免疫反應(yīng)頻率與臨床特征的關(guān)系

3 討論

NY-ESO-1基因定位于X染色體的Xq28區(qū)域，最初是Chen等[9]通過用食管癌患者的自體血清篩選腫瘤來源的cDNA表達文庫來描述食管癌的，是新基因家族的第一個成員，被鑒定為一種能誘導高效價IgG體液反應(yīng)的腫瘤抗原。之后的研究證實NY-ESO-1也可以誘導細胞免疫反應(yīng)，Jger等[10]首次報道在1例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中對NY-ESO-1的體液和細胞免疫反應(yīng)可能同時發(fā)生。NY-ESO-1在正常組織中的表達局限于生殖細胞和胎盤細胞[11]，而在多種腫瘤中有廣泛表達，包括脂肪肉瘤(88%)[12]、神經(jīng)母細胞瘤(82%)[13]、黑色素瘤(45%)[14]、卵巢癌(43%)[15]、食管癌(41.4%)[16]等，使得NY-ESO-1成為脫靶毒性有限的靶點，在多種癌癥類型中具有廣泛的應(yīng)用前景，強調(diào)了它作為特定免疫治療程序靶點的高度潛在相關(guān)性，因此NY-ESO-1可以作為腫瘤免疫治療的理想靶點之一。

NY-ESO-1在多種實體腫瘤中的研究相繼開展，使用ICS技術(shù)研究報道較少。以往研究大多數(shù)使用ELISA試驗、免疫組織化學方法等，上述方法只能對單一細胞因子表達進行檢測，且無法明確單細胞水平多種細胞因子的共表達水平，無法對雙重乃至多重細胞因子分泌的T細胞亞群進行分析。ICS技術(shù)依賴于在刺激后不久向細胞中添加蛋白質(zhì)分泌抑制劑，這使得細胞因子可以保留在抗原特異的細胞內(nèi)，以便隨后用熒光抗體進行細胞因子和細胞標志物的染色，與其他方法相比，細胞因子保留在細胞內(nèi)不僅可以加速它們的檢測，而且還可以鑒別與此功能相關(guān)的特定細胞群[8]。

為了評價NY-ESO-1抗原作為宮頸癌特異性免疫治療靶點的價值，本研究對NY-ESO-1抗原肽刺激宮頸癌患者外周血產(chǎn)生的特異性T細胞免疫反應(yīng)進行了綜合分析。在宮頸癌中，Sarcevic等[17]報道通過免疫印跡和免疫細胞化學方法，經(jīng)NY-ESO-1/LAGE-1特異性試劑染色后，可以在較小的樣本系列中檢測到頻率相當?shù)年栃苑磻?yīng)(7/11，63.6%)。其次Napoletano等[18]應(yīng)用免疫組織化學方法對162例接受根治性子宮切除術(shù)、新輔助化療或盆腔疾病復(fù)發(fā)患者的宮頸癌標本進行分析后發(fā)現(xiàn)，宮頸癌常表達腫瘤睪丸腫瘤相關(guān)抗原，與腫瘤預(yù)后相關(guān)，早期腫瘤中NY-ESO-1與腫瘤分級相關(guān)，NY-ESO-1的表達率不受系統(tǒng)治療的影響。本課題組既往用酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)檢測NY-ESO-1抗原肽刺激食管鱗癌患者PBMCs分泌IFN-γ的特異性CTL(細胞毒性T淋巴細胞)反應(yīng)頻率為19.6%(10/51)，其在食管鱗癌臨床特征中的差異無統(tǒng)計學意義[19]，本研究采用ICS技術(shù)，分析了NY-ESO-1抗原肽刺激宮頸癌初治患者外周血產(chǎn)生的特異性T細胞免疫反應(yīng)，免疫應(yīng)答陽性率為67.4%，較前增加，提示ICS技術(shù)可檢測到NY-ESO-1能在宮頸癌中表達，具有免疫原性，有成為宮頸癌免疫治療靶點的可能。針對該抗原的免疫治療在涉及NY-ESO-1表達腫瘤的臨床試驗中顯示出一些希望，特別是在滑膜肉瘤和惡性黑色素瘤中[20-22]。

有研究顯示，有流產(chǎn)史以及2次或2次以上的剖腹產(chǎn)史等是高級別CIN的重要危險因素，高齡是高級別CIN的統(tǒng)計學顯著因素，宮頸癌篩查應(yīng)特別關(guān)注具有上述危險因素的婦女，縮短篩查間隔時間[23]。其次，對病毒感染產(chǎn)生CD8+T細胞反應(yīng)的能力隨著年齡的增長而顯著變化[24]，Avelino-Silva等[25]回顧近20年來的文獻發(fā)現(xiàn)HIV感染中導致CD4+和CD8+T細胞耗盡的慢性免疫激活隨著年齡的增長而惡化，Murasko等[26]發(fā)現(xiàn)老年小鼠IFN-α/β、IFN-γ和/或IL-12水平的變化，加上T細胞的內(nèi)源性改變，可能導致老年小鼠體內(nèi)病毒特異性CD8+T細胞數(shù)量的減少和病毒清除的延遲。在本研究中，NY-ESO-1特異性T細胞免疫反應(yīng)陽性率與患者臨床特征(家族史、絕經(jīng)史、腫瘤大小、腫瘤大體類型、組織病理類型、腫瘤分化程度、FIGO分期、HPV感染、SCC、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)之間分組比較中，差異無統(tǒng)計學意義，其中無流產(chǎn)史患者NY-ESO-1特異性CD4+T細胞免疫反應(yīng)陽性率明顯高于有流產(chǎn)史患者，二者差異有統(tǒng)計學意義(P=0.018)；≤52歲患者NY-ESO-1特異性CD8+T細胞免疫反應(yīng)陽性率明顯高于>52歲患者，二者統(tǒng)計學差異為臨界值(P=0.052)，表明有無流產(chǎn)史和年齡的差異可能是導致NY-ESO-1特異性抗原多肽反應(yīng)差異的原因之一，但也有可能是因為本研究病例數(shù)少，需進一步研究探索導致其差異的根本原因。提示，在今后的免疫治療中，為保證無流產(chǎn)史和年輕宮頸癌患者的治療效果，應(yīng)增加提高免疫的相應(yīng)治療。

綜上所述，本研究通過探索宮頸癌中NY-ESO-1特異性T細胞免疫反應(yīng)差異與臨床特征之間的聯(lián)系，為今后NY-ESO-1作為宮頸癌免疫治療的靶點提供一定實驗室依據(jù)及線索，但仍需擴大樣本量進行深入研究。