范佩文， 馬苗苗， 馮亞寧， 王若崢

(1新疆腫瘤防治研究所， 烏魯木齊 830011； 2新疆腫瘤學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830011；3中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤免疫與放療研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830011；4新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院放療二科，烏魯木齊 830001)

宮頸癌目前依然是新疆地區(qū)婦女面臨的重大疾患之一，HPV作為宮頸癌獨(dú)立誘發(fā)因素，在宮頸病變惡化過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)，作為一種外源性病毒抗原，可以誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)。腫瘤微環(huán)境中包含癌細(xì)胞、免疫細(xì)胞和多種細(xì)胞因子等成分，其中T細(xì)胞的數(shù)量和功能對(duì)宿主腫瘤細(xì)胞的清除起至關(guān)重要的作用，腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的功能耗竭是造成腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的主要機(jī)制，抗腫瘤應(yīng)答的強(qiáng)弱直接影響腫瘤患者的預(yù)后[1-3]。

細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4 (cytotoxic-T-lymphocyte-antigen-4, CTLA-4)又稱CD152，屬于CD28免疫球蛋白亞家族，是一種主要由T細(xì)胞表達(dá)的抑制性受體，其基因位于2號(hào)染色體長(zhǎng)臂33帶(2q33)上，其配體CD80和CD86通常存在于抗原遞呈細(xì)胞的表面，結(jié)合后分別產(chǎn)生共刺激或共同抑制反應(yīng)[4-5]。研究表明，CTLA-4等免疫檢查點(diǎn)分子高表達(dá)是腫瘤T細(xì)胞功能性耗竭的重要標(biāo)志[6-7]，并與腫瘤患者臨床特征、療效和預(yù)后有關(guān)[8-9]。通過阻斷這些免疫檢查點(diǎn)的信號(hào)通路，能有效地恢復(fù)耗竭T細(xì)胞的功能[10-11]。

本研究納入HPV16型感染的中晚期宮頸鱗癌患者，采用多色流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)患者外周血和癌組織中T細(xì)胞上CTLA-4表達(dá)情況，對(duì)比分析宮頸癌患者外周血、癌組織中CD4+、CD8+T細(xì)胞上CTLA-4的表達(dá)差異，探討其表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性，檢測(cè)宮頸癌患者放射治療過程中PBMCs中T細(xì)胞上CTLA-4等免疫檢查點(diǎn)分子的動(dòng)態(tài)改化，為中晚期宮頸鱗癌患者放療聯(lián)合免疫治療的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象收集2017年2月-2018年8月，就診于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科放射治療病區(qū)的63例中晚期宮頸鱗癌患者。所有患者均為HPV16型感染，年齡39～80歲；患者中IIB期31例,占49.2%，IIIA～I(xiàn)IIB期32例(50.7%)；低分化鱗癌20例(31.7%)，中分化鱗癌37例(58.7%)，乳頭狀鱗癌6例(9.5%)。收集行放射治療前、治療中和治療結(jié)束資料完整的患者22例，年齡范圍31～71歲；IIB期12例，III期10例；低分化鱗癌10例，中分化鱗癌12例。所有患者的治療均遵照衛(wèi)計(jì)委宮頸癌診療規(guī)范，NCCN指南(2018版)，行放射治療的患者采用適形調(diào)強(qiáng)技術(shù)進(jìn)行盆腔外照射，外照射劑量為45～50 Gy；腔內(nèi)放療采用Ir192后裝機(jī)，腔內(nèi)后裝治療A點(diǎn)劑量為6G y/周，A點(diǎn)總劑量為36～42 Gy，周圍器官的保護(hù)劑量不大于A點(diǎn)劑量的60%。放療中給予同步化療，4～6個(gè)周期的順鉑40 mg/m2靜脈滴注，或3～4個(gè)周期的紫杉醇135 mg/m2靜脈滴注。對(duì)于不能耐受或拒絕化療的患者，僅行局部放射治療。

1.2 研究方法

1.2.1 血液樣本留取和處理 采集患者EDTA抗凝外周血10ml，經(jīng)4℃，3 000 rpm離心10 min后分離獲得血漿和血細(xì)胞，血細(xì)胞中按1：1體積加入RPMI 1640培養(yǎng)基(Sigma公司)混勻，加入等體積淋巴細(xì)胞分離液(Sigma公司)，密度梯度離心后獲得外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。

1.2.2 組織樣本留取和處理 取常規(guī)病理檢查之外剩余的活檢組織標(biāo)本，大小約3 mm×3 mm×3 mm/塊，經(jīng)RPMI-1640培養(yǎng)基漂洗后剪碎轉(zhuǎn)移到中，按照組織分離試劑盒說明書加入所需的分解酶，將組織消化懸液混勻后置于組織分離器(美天旎生物技術(shù)有限公司)上進(jìn)行初步分解后，將C管置于旋轉(zhuǎn)器中進(jìn)一步利用分解酶消化獲取單細(xì)胞。將分解消化后的組織懸液經(jīng)細(xì)胞篩過濾以獲取包含腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)的單細(xì)胞懸液。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CTLA-4在CD4+T和CD8+T細(xì)胞上的表達(dá) 向分取的PBMCs和TILs中離心加入Live/dead染料，4℃避光染色20 min后，用FACS 清洗液洗滌兩次后，加入針對(duì)表面抗原的CD3(AF700， BD公司)、CD4(FITC， BioLegend公司)、CD8(APC-H7， BD公司)和CTLA-4(PE-Cy7， BioLegend公司)熒光標(biāo)記抗體，再次避光染色后，用BD LSRFortessa流式細(xì)胞分析儀(BD公司)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件包，圖表繪制采用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行；PBMCs和TILs中CD4+、CD8+T細(xì)胞上免疫檢查點(diǎn)分子CTLA-4的表達(dá)結(jié)果為非正態(tài)分布，以中位數(shù)(25%，75%)描述；組間比較采用秩和檢驗(yàn)；PBMCs和TILs中CD4+、CD8+T細(xì)胞上CTLA-4表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman分析；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 中晚期宮頸鱗癌患者PBMCs和TILs中CD4+、CD8+T細(xì)胞CTLA-4的表達(dá)63例患者 PBMCs中CD4+ T細(xì)胞的CTLA-4表達(dá)量為4.59%，CD8+CTLA-4+T細(xì)胞的表達(dá)量為22.50(8.36，25.40)%； TILs中CD4+CTLA-4+T細(xì)胞的表達(dá)量為5.20(3.01，9.72)%，CD8+CTLA-4+T細(xì)胞的表達(dá)量為4.95(2.60，15.80)%。PBMCs和TILs中CD4+ T細(xì)胞上CTLA-4表達(dá)量對(duì)比分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-0.751，P=0.052)；PBMCs中CD8+ T細(xì)胞上CTLA-4的表達(dá)量高于TILs，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-5.445，P<0.001)。見圖1。

2.2 中晚期宮頸鱗癌患者PBMCs和TILs中CD4+、CD8+T細(xì)胞CTLA-4表達(dá)的相關(guān)性患者PBMCs和TILs中CD4+CTLA-4+T細(xì)胞的相關(guān)性分析方程Y=-0.103X+8.827，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.081，P=0.530)；PBMCs和TILs中CD8+CTLA-4+T細(xì)胞的相關(guān)性分析方程Y=0.361X+17.250，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.184，P=0.149)； CD4+CTLA-4+和CD8+CTLA-4+T細(xì)胞在PBMCs和TILs中表達(dá)無(wú)相關(guān)性。見圖2。

圖1 中晚期宮頸鱗癌患者PBMCs和TILs中CD4+T、CD8+T細(xì)胞CTLA-4的表達(dá)

圖2 中晚期宮頸癌患者PBMCs和TILs中CD4+T、CD8+T細(xì)胞CTLA-4表達(dá)的相關(guān)性

2.3 中晚期宮頸鱗癌患者PBMCs和TILs中CD4+、CD8+T細(xì)胞CTLA-4的表達(dá)與臨床特征的對(duì)比中晚期宮頸鱗癌患者PBMCs中T細(xì)胞上CTLA-4的表達(dá)量在病理分級(jí)中比較，均發(fā)現(xiàn)在乳頭狀鱗癌中最高，其中CD4+T細(xì)胞的CTLA-4表達(dá)量中分化組為4.33(2.37，7.25)%、低分化組為4.97(1.48，8.78)%，乳頭狀組為17.55(8.29，31.90)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=7.741，P=0.021)；CD8+CTLA-4+T細(xì)胞的表達(dá)量在病理分級(jí)中比較，中分化組21.80(11.69，26.75)%、低分化組22.20(7.21，29.33)%，乳頭狀分組43.25(31.30，49.38)%，差異有統(tǒng)計(jì)意義(Z=7.741，P=0.021)；CTLA-4的表達(dá)在其他臨床特征間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；颊逿ILs中CD4+CTLA-4+T和CD8+CTLA-4+T細(xì)胞表達(dá)量在各臨床特征間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1、2。

2.4 宮頸鱗癌患者PBMCs中放射治療前、中、后CD4+、CD8+T細(xì)胞CTLA-4表達(dá)的對(duì)比22例行放射治療的患者PBMCs中CD4+CTLA-4+T細(xì)胞的表達(dá)量在治療前、中和結(jié)束時(shí)分別為為3.94(1.85，5.70)%、6.80(3.38，41.13)%和7.86(4.47，13.23)%；放療前與放療中比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.448，P=0.013)；放療前與放療結(jié)束時(shí)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.653，P=0.008)；患者PBMCs中CD4+CTLA-4+T細(xì)胞的表達(dá)量隨放療進(jìn)程呈升高趨勢(shì)。CD8+ T細(xì)胞的CTLA-4表達(dá)量在放療前、中和結(jié)束時(shí)分別為23.40(11.78，3.98)%、27.90(21.95，57.20)%和37.10(18.80，51.73)%，三者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖3。

表1 宮頸鱗癌患者PBMCs中CD4+T、CD8+T細(xì)胞CTLA-4的表達(dá)與臨床特征的比較

表2 宮頸鱗癌患者TILs中CD4+T、CD8+T細(xì)胞CTLA-4的表達(dá)與臨床特征的比較

圖3 22例中晚期宮頸鱗癌患者放療前、中、后PBMCs中CD4+T、CD8+T細(xì)胞CTLA-4的表達(dá)

3 討論

機(jī)體的免疫功能和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對(duì)清除腫瘤細(xì)胞和防止腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵作用[12-13]。正常情況下，機(jī)體可以利用免疫系統(tǒng)清除體內(nèi)的HPV，然而隨著持續(xù)感染的發(fā)生，機(jī)體的免疫系統(tǒng)對(duì)外源性抗原的識(shí)別和清除能力下降，使得受到HPV感染的細(xì)胞在宮頸局部組織中存活并大量繁殖，最終導(dǎo)致惡性腫瘤的生成[14-15]。作為影響T細(xì)胞功能的關(guān)鍵因素，CTLA-4和抗CTLA-4抗體通過介入免疫微環(huán)境，發(fā)揮高效功效并補(bǔ)充傳統(tǒng)藥物而具有特殊的治療作用，從而為宮頸癌等惡性腫瘤的治療創(chuàng)造了新的機(jī)會(huì)。

已有研究報(bào)道,在卵巢癌微環(huán)境中，CTLA-4等共抑免疫檢查點(diǎn)分子參與可導(dǎo)致TILs失活，CTLA-4的阻斷有利于卵巢腫瘤碎片中CD8+ TILs的增殖，在腫瘤微環(huán)境中靶向CTLA-4可豐富腫瘤反應(yīng)性TILs，并可能提高基于TILs的過繼療法在卵巢癌中的臨床療效[16]。此外，有學(xué)者利用37例宮頸癌患者的癌以及陽(yáng)性淋巴結(jié)組織進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTLA-4、PD-1、Tim-3等免疫檢查點(diǎn)分子在T細(xì)胞上均有表達(dá)，并且在CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)量CTLA-4>PD-1>Tim-3； CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)量PD-1>CTLA-4>Tim-3[17]。本研究通過對(duì)HPV16型感染的中晚期宮頸癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，外周血PBMC中CTLA-4的表達(dá)量在CD8+T細(xì)胞中22.50(8.36，25.40)%高于CD4+T細(xì)胞中4.59(2.06，7.78)%；而癌組織TILs中CD4+CTLA-4+T細(xì)胞的表達(dá)量5.20(3.01，9.72)%高于CD8+CTLA-4+T細(xì)胞的表達(dá)量為4.95(2.60，15.80)%，這與上述學(xué)者的研究結(jié)果較為一致。

本研究分析發(fā)現(xiàn)患者CD8+CTLA-4+T細(xì)胞的表達(dá)量在PBMCs中顯著高于TILs中(P<0.01)，而通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)PBMCs與TILs中的表達(dá)不存在相關(guān)性。推測(cè)可能由于CTLA-4基因可編碼2種形式的蛋白：一種是膜性蛋白，另一種是可溶性的單體蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，CTLA-4表達(dá)于活化的CD4+、CD8+T細(xì)胞膜上，在靜息和幼稚T細(xì)胞中不表達(dá)，而是滯留在某些細(xì)胞器中，如高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、囊泡等；當(dāng)T細(xì)胞活化后，這些滯留的CTLA-4蛋白能夠迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜表面[18]。Adriana 等[19]測(cè)定了CTLA-4在不同宮頸癌細(xì)胞系細(xì)胞表面的表達(dá)，結(jié)果顯示其在細(xì)胞表面非常低或不表達(dá)，因此進(jìn)一步評(píng)估了該蛋白的細(xì)胞內(nèi)形態(tài)，發(fā)現(xiàn)所有宮頸癌細(xì)胞系都表達(dá)CTLA-4 (0.5～35%)，也證明了該推測(cè)。另外本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞技術(shù)僅檢測(cè)到外周血中T細(xì)胞膜上CTLA-4表達(dá)，也可能是出現(xiàn)此結(jié)果的原因，需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

有研究者利用宮頸癌患者和健康女性的血漿，采用改良的ELISA方法檢測(cè)CTLA-4自身抗體，發(fā)現(xiàn)CTLA-4自身抗體在宮頸癌患者中的表達(dá)量高于健康女性對(duì)照者，在宮頸癌II期患者中高于I期患者[20]。本研究探討了外周血和癌組織中細(xì)胞上CTLA-4的表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，PBMCs中CD4+和CD8+T細(xì)胞CTLA-4的表達(dá)量在病理分級(jí)上存在差異，在乳頭狀鱗癌組中表達(dá)量高于低分化組，中分化組表達(dá)量最低(P<0.05)。既往研究證實(shí)，在多種惡性腫瘤中CD4+或CD8+T細(xì)胞上CTLA-4的表達(dá)與臨床特征密切相關(guān)，如病理分級(jí)、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，而免疫檢查點(diǎn)分子的過度表達(dá)對(duì)患者的預(yù)后也有影響[21]。

已有研究表明，電離輻射會(huì)直接造成DNA的損傷，并產(chǎn)生活性氧和自由基，導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)膜損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞畸形、凋亡、壞死甚至癌變[22]。本研究納入了22例接受放射治療的患者，收集放放療前、中期及結(jié)束時(shí)3個(gè)階段的外周血，檢測(cè)CTLA-4在T細(xì)胞中的表達(dá)情況。分析發(fā)現(xiàn)，隨著放療劑量的累積，患者CD4+T、CD8+T細(xì)胞中CTLA-4表達(dá)均有升高趨勢(shì)，隨著治療結(jié)束表達(dá)有下降趨勢(shì)，其中在CD4+T細(xì)胞中CTLA-4的表達(dá)量在放療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示放射治療可能對(duì)機(jī)體有免疫抑制的影響。Wilkins等[23]報(bào)道了抗CTLA-4抑制劑ipilimumab聯(lián)合姑息性放療在39例非小細(xì)胞肺癌患者中的臨床結(jié)果和轉(zhuǎn)譯結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)有18%的患者存在放射學(xué)反應(yīng)，并且有31%的患者病情得到了控制。這些臨床結(jié)果似乎優(yōu)于僅使用ipilimumab的歷史研究，并提示在一些患者中，輻射可能觸發(fā)了全身，即所謂的遠(yuǎn)性免疫反應(yīng)。表明通過優(yōu)化放射治療分割計(jì)劃和抗CTLA-4抑制聯(lián)合應(yīng)用可以產(chǎn)生額外反應(yīng)效應(yīng)。

綜上所述，CTLA-4在宮頸癌患者外周血和癌組織中均有表達(dá)，且隨著放射治療劑量的累加存在變化。隨著對(duì)T細(xì)胞耗竭機(jī)制的深入研究和對(duì)腫瘤治療方法的不斷探索，新的免疫檢查點(diǎn)分子靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)日新月異，靶向藥物的推陳出新，相信未來免疫治療會(huì)給宮頸癌患者的治療帶來更多希望。