張?jiān)茷I 任憲云 高保全 呂建建 王 磊 劉 萍

三疣梭子蟹C-JUN氨基末端激酶基因克隆及在病原脅迫后的表達(dá)特征分析*

張?jiān)茷I1,3任憲云2,3高保全2,3呂建建2,3王 磊1,3劉 萍2,3①

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海 201306；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

C-JUN氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)作為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族的重要一員，在細(xì)胞增殖、凋亡和免疫應(yīng)激等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。為深入研究基因的免疫防御機(jī)制，本研究從三疣梭子蟹()轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到基因的EST序列，利用RACE擴(kuò)增技術(shù)克隆得到該基因全長(zhǎng)序列，命名為，cDNA全長(zhǎng)為3240 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)為1380 bp，編碼459個(gè)氨基酸，具有TPY磷酸化位點(diǎn)的S_TKC保守結(jié)構(gòu)域，是基因家族典型特征。組織表達(dá)分布結(jié)果顯示，基因在所有組織中均有表達(dá)；Real-time PCR檢測(cè)不同病原刺激下基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，注射副溶血弧菌()后，該基因顯著下調(diào)表達(dá)(<0.05)；而注射白斑綜合征病毒(WSSV)后，該基因顯著上調(diào)表達(dá)(<0.05)。綜上所述，基因是一種廣泛表達(dá)基因，且在不同的病原感染情況下，該基因的表達(dá)模式存在差異，在免疫防御過(guò)程中具有重要作用。

三疣梭子蟹；；基因克?。徊≡腥?；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

C-JUN氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)在1990年被發(fā)現(xiàn)，是形成絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族的重要亞基?；蚣易寰哂蠺HR-Pro-Tyr(TPY)磷酸化位點(diǎn)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(S_TKC)典型結(jié)構(gòu)域，是上游基因MKK4與MKK7的激活區(qū)域，磷酸化的可激活下游各種轉(zhuǎn)錄因子(Davis, 2000; Minden, 2008)和非轉(zhuǎn)錄因子(Lin, 2003)，參與細(xì)胞增殖(Zhang, 2002)、凋亡(Kyriakis, 1994)、分化和免疫應(yīng)激(Huang,2009)等生理過(guò)程。國(guó)內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)，JNK可介導(dǎo)多種外界因素引起的細(xì)胞凋亡，如Dhanasekaran等(2008)研究發(fā)現(xiàn)，JNK可活化其下游轉(zhuǎn)錄因子c-JUN/AP-1的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)凋亡蛋白的表達(dá)；活化P53基因的表達(dá)可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡(Jones, 2008)；JNK還可以介導(dǎo)非轉(zhuǎn)錄因子BCL-2家族基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡(Aoki, 2002)。JNK除在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用外，在機(jī)體免疫應(yīng)激過(guò)程中也發(fā)揮重要作用，如在果蠅()中，JNK基因可以激活脂肪體中抗菌肽基因的表達(dá)，參與對(duì)致病菌(Bond, 2009)、真菌(Sluss, 1996)和病毒(Delaney, 2006)的免疫防御；Shi等(2012)在凡納濱對(duì)蝦()中獲得的JNK同源基因與WSSV的復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)；Zhu等(2016)在中華絨螯蟹()中發(fā)現(xiàn)，JNK信號(hào)通路可調(diào)節(jié)抗菌肽(AMPs)的表達(dá)?？梢?jiàn)JNK在機(jī)體的免疫防御過(guò)程中具有極其重要的作用。然而，在三疣梭子蟹()中，有關(guān)JNK是否參與細(xì)胞凋亡、免疫防御的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。

三疣梭子蟹具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是我國(guó)重要的海產(chǎn)養(yǎng)殖品種(任海波等, 2018）。但由于養(yǎng)殖環(huán)境的破壞與病害頻發(fā)，三疣梭子蟹養(yǎng)殖規(guī)模呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，其中，副溶血弧菌()和白斑綜合征病毒(WSSV)是導(dǎo)致三疣梭子蟹病害頻發(fā)的主要病原(周俊芳等, 2014; 李盧, 2005; 閻斌倫等, 2010)。因此，本研究采用RACE技術(shù)克隆三疣梭子蟹的基因，通過(guò)生物學(xué)軟件分析其基因結(jié)構(gòu)與功能，并利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)(qRT-PCR)對(duì)其在不同病原感染下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，為進(jìn)一步探索三疣梭子蟹基因在免疫防御中的作用機(jī)制提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品的獲取

三疣梭子蟹采集于山東省濰坊市昌邑海豐養(yǎng)殖基地，選擇健康的三疣梭子蟹200只[(25±3) g]，在10 m2的室內(nèi)水池中暫養(yǎng)7 d，水溫為(25±2)℃，鹽度為33，持續(xù)充氧，為保證水質(zhì)良好，每天換水1/3，定時(shí)、定點(diǎn)、定量投喂新鮮雜魚(yú)，投喂量為其體重的30%左右。隨機(jī)選取3只暫養(yǎng)后的健康三疣梭子蟹，分別取其10個(gè)組織(腦、肝胰腺、血細(xì)胞、肌肉、胸腺、腸、眼柄、胃、鰓和心臟)存于液氮，用于組織表達(dá)分布分析，其中，血細(xì)胞800×g 4℃離心10 min，去上清液，保留血細(xì)胞，并保存于液氮中。

將剩余的健康三疣梭子蟹平均分為3組，即對(duì)照組(甲殼動(dòng)物生理鹽水)、副溶血弧菌感染組(1×107CFU/ml)和WSSV(3.7×107copy/ml)感染組，每組50只以確保有足夠的取樣個(gè)體數(shù)量，濃度參照張杰等(2018)，注射量為100 μl，分別在感染0、3、6、12、24、48和72 h時(shí)取其鰓、肝胰腺和血細(xì)胞組織，每組取3只混合放置在1.5 ml離心管中。其中，血細(xì)胞800×g 4℃離心10 min，去上清液，保留血細(xì)胞，并保存于液氮中，用于后續(xù)總RNA提取等。

1.2 總RNA提取與RACE模板合成

將保存于液氮未處理的組織進(jìn)行充分研磨，采用TRIzol?Reagent(Roche公司)方法進(jìn)行總RNA提取，然后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)(NanoDrop 2000, Thermo)檢測(cè)其質(zhì)量和濃度，將高質(zhì)量的RNA進(jìn)行分裝保存(–80℃)。將各組織中高質(zhì)量的總RNA均勻混合，并使用SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit (TaKaRa公司)試劑盒合成3′和5′ RACE cDNA模板(–80℃分裝保存)，用于后續(xù)基因克隆實(shí)驗(yàn)。

1.3 PtJNK基因cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增

根據(jù)三疣梭子蟹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到的EST序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3′和5′ RACE特異性引物及通用引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)，使用Trans?DNA高保真聚合酶(北京全式金生物公司)進(jìn)行3′和5′末端巢式PCR擴(kuò)增，第1輪使用UPM通用引物，10 μl反應(yīng)體系：0.5 μl模板、0.4 μl Forward/Reverse Primer (10 μmol/L)、5 μl Premix(LAVer 2.0)、ddH2O補(bǔ)足；程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。第2輪以第1輪反應(yīng)為模板，使用NUP通用引物，20ml反應(yīng)體系，程序：94℃ 5min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。將獲得的PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將檢測(cè)合理的目的條帶進(jìn)行切膠回收(TaKaRa Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0)，與pMD-18T載體(TaKaRa)連接3 h，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(TSINGKE)中，涂布于含氨芐的固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性單克隆，加入含100 μg/ml氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，用M13-47/48引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，并將檢測(cè)準(zhǔn)確的目的菌液送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 本研究所用引物序列

Tab.1 Nucleotide sequences of the PCR primers used in this study

1.4 PtJNK基因序列生物信息學(xué)分析

利用Contig Express軟件將3′和5′克隆序列與EST序列進(jìn)行拼接、驗(yàn)證，得到基因的cDNA全長(zhǎng)，利用NCBI-BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線軟件對(duì)基因序列進(jìn)行比對(duì)，并使用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi)在線軟件預(yù)測(cè)基因序列的開(kāi)放閱讀框(ORF)。利用ExPASy(http://cn.expasy.org/tools/pi_tool.html)、SMART (http://smart.embl-heidelberg.de)、SignalP 4.1 (http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線生物學(xué)分析軟件對(duì)基因編碼的氨基酸進(jìn)行物理性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽的預(yù)測(cè)。使用DNA MAN 5.2.9軟件對(duì)不同物種的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，并通過(guò)MEGA 6.0軟件(Tamura, 2011)采用鄰接法(Neighbor-Joining method) (Saitou, 1987)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

1.5 PtJNK基因組織表達(dá)分析

將提取的總RNA用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) kit (南京諾維贊)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于組織表達(dá)定量檢測(cè)。根據(jù)基因的全長(zhǎng)序列，通過(guò)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR特異性引物，內(nèi)參基因選用β-actin(表1)。采用10 μl qRT-PCR體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (2×) 5.0 μl，正/反向引物(10 μmol/L) 0.4 μl，ROX Reference DyeⅡ (50×) 0.2 μl，cDNA模板2.0 μl，滅菌水3.0 μl。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1.0 min，95℃ 15 s。采用2–??Ct方法(Livak, 2001)對(duì)熒光定量結(jié)果進(jìn)行分析，并通過(guò)SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析(<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 PtJNK基因全長(zhǎng)與序列結(jié)構(gòu)特征

利用RACE方法得到三疣梭子蟹基因全長(zhǎng)序列3240 bp，命名為(GenBank登錄號(hào)：MK28792)(圖1)。生物學(xué)軟件分析顯示，該基因包含5′非編碼區(qū)668 bp，3′非編碼區(qū)1192 bp，其開(kāi)放閱讀框(ORF)1380 bp，編碼459個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為51.7 kDa，理論等電點(diǎn)為6.47。SMART、Signal 4.1在線軟件分析顯示，該氨基酸序列具有TPY磷酸化位點(diǎn)的S_TKC保守結(jié)構(gòu)域(圖2)，屬于基因家族典型結(jié)構(gòu)特征，無(wú)信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.2 PtJNK氨基酸同源性與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

利用Blast在線軟件對(duì)氨基酸序列和其他物種的JNK氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，PtJNK氨基酸序列與鋸緣青蟹() SpJNK氨基酸序列同源性最高(91.7%)，其次是中華絨螯蟹EsJNK(89.98%)、凡納濱對(duì)蝦PvJNK(88.52%)、日本對(duì)蝦()PjJNK(87.90%)。利用DNA MAN對(duì)多個(gè)序列進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)(圖3)，每個(gè)氨基酸序列都具有TPY磷酸化位點(diǎn)的S_TKC保守結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)多個(gè)氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)(圖4)，三疣梭子蟹與鋸緣青蟹和中華絨螯蟹聚為一支，其次與凡納濱對(duì)蝦和日本對(duì)蝦聚為一類。

2.3 PtJNK基因組織表達(dá)分析

2.3.1全組織相對(duì)表達(dá)分析 利用qRT- PCR技術(shù)對(duì)三疣梭子蟹不同組織的mRNA進(jìn)行相對(duì)表達(dá)定量檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖5)，在各組織中都有表達(dá)，且表達(dá)存在顯著差異(<0.05)。實(shí)驗(yàn)以肝胰腺作為對(duì)照，其中，胃和肌肉中的表達(dá)量最高(與肝胰腺的表達(dá)水平相比分別為3.98和3.78倍)；其次在鰓的表達(dá)水平是肝胰腺的1.79倍；在心臟略低于肝胰腺的表達(dá)水平，在血細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量較低。因此，推測(cè)可能在三疣梭子蟹中發(fā)揮不同的作用，其作用因組織類型的不同而不同。

圖1 三疣梭子蟹PtJNK基因cDNA全長(zhǎng)及其編碼的氨基酸序列

起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)用方框標(biāo)出；陰影部分為S_TKC保守結(jié)構(gòu)域；TPY磷酸化位點(diǎn)用單下劃線標(biāo)出

Boxes: Start codon (ATG) and stop codon (TAG); Shadow: S_TKC Conservative domain; Underline: TPY phosphorylation

圖2 三疣梭子蟹PtJNK基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域位置

圖3 三疣梭子蟹PtJNK氨基酸序列的多序列比對(duì)

各物種名稱及GenBank登錄號(hào)：三疣梭子蟹MK28792；鋸緣青蟹AYK28495.1；中華絨螯蟹AHG95993.1；凡納濱對(duì)蝦XP_027218684.1；日本對(duì)蝦BAI87826.1；家蠶NP_001103396.1；果蠅AAB97094.1；乾木白蟻PNF21055.1；內(nèi)華達(dá)古白蟻 KDR18179.1；小鼠BAA85875.1；人NP_001310231.1

Name of each species and GenBank accession numbers:MK28792;AYK28495.1;AHG95993.1;XP_027218684.1;BAI87826.1;NP_001103396.1;AAB97094.1;PNF21055.1;KDR18179.1;BAA85875.1;NP_001310231.1

圖4 基于JNK氨基酸序列構(gòu)建的不同物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖5 三疣梭子蟹PtJNK基因在不同組織中的表達(dá)

相同字母代表差異不顯著(0.05)，不同字母代表差異顯著(<0.05)，下同

Same letters indicated no significantly different (0.05), different letters indicated significantly different (?0.05). The same as below

2.3.2 不同病原刺激下基因的表達(dá)分析 本研究利用qRT-PCR技術(shù)，研究在不同的病原刺激下，三疣梭子蟹血細(xì)胞、肝胰腺和鰓中基因的表達(dá)情況(圖6)。在副溶血弧菌感染后，基因在血細(xì)胞、鰓和肝胰腺3個(gè)組織中，與對(duì)照組相比基本呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)趨勢(shì)，且呈現(xiàn)先下降后上升再下降后趨于平衡的表達(dá)模式。在血細(xì)胞中，分別在12 h和24 h高于對(duì)照組表達(dá)量，達(dá)到最高表達(dá)水平，為對(duì)照組的1.79倍和1.54倍；在肝胰腺中，在12 h達(dá)到最高值，為對(duì)照組的0.63倍；在鰓中，在6 h達(dá)到最高表達(dá)量，為對(duì)照組的0.61倍，在48 h和72 h達(dá)到恒定水平，為對(duì)照組的0.56倍和0.59倍。

在注射WSSV后，基因在血細(xì)胞、肝胰腺和鰓3個(gè)組織中，相對(duì)對(duì)照組呈上調(diào)表達(dá)。在血細(xì)胞中呈先下降后上升再下降的表達(dá)模式，在24 h達(dá)到最大值，為對(duì)照組的18.21倍；在肝胰腺中，基因的表達(dá)整體呈先上升后下降的表達(dá)趨勢(shì)，在12 h表達(dá)量達(dá)到最大值，為對(duì)照組的4.91倍；在鰓中，基因的表達(dá)整體呈先上升后下降再上升的表達(dá)趨勢(shì)，其中，在12 h下調(diào)至最低水平，為對(duì)照組的0.38倍。

圖6 三疣梭子蟹在不同病原感染下PtJNK在血細(xì)胞(A)、肝胰腺(B)和鰓(C)中的表達(dá)模式

感染組間沒(méi)有進(jìn)行差異顯著分析

No analysis was performed between infected groups

3 討論

為更加深入了解三疣梭子蟹基因的分子特征，本研究首次獲得基因的全長(zhǎng)序列，cDNA全長(zhǎng)為3240 bp。經(jīng)生物學(xué)軟件分析，基因含有TPY磷酸化位點(diǎn)的S_TKC保守結(jié)構(gòu)域，是C-JUN氨基末端激酶(JNK)基因家族的典型結(jié)構(gòu)域。氨基酸多重序列比對(duì)結(jié)果顯示，PtJNK氨基酸序列與其他物種具有高度的保守性。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，無(wú)脊椎動(dòng)物與脊椎動(dòng)物有關(guān)基因在進(jìn)化上并沒(méi)有十分密切的聯(lián)系，而三疣梭子蟹基因與鋸緣青蟹、中華絨螯蟹聚為一支。綜上所述，該序列確定為三疣梭子蟹基因，且在進(jìn)化上高度保守。

基因可由各種環(huán)境應(yīng)激激活，如細(xì)菌或病毒感染、氧化應(yīng)激等。為了深入研究基因在三疣梭子蟹中的功能，進(jìn)行了病原感染實(shí)驗(yàn)，并利用qRT- PCR對(duì)基因的組織表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，該基因在各檢測(cè)組織(胃、肌肉、腸、眼柄、胸腺、鰓、腦、心臟、肝胰腺和血細(xì)胞)中均有表達(dá)，其中，在胃和肌肉中表達(dá)量最高。時(shí)恭芳(2017)在對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦()的研究中發(fā)現(xiàn)，在各組織中廣泛表達(dá)，其中，在血淋巴、鰓和腸道中高表達(dá)；Sun等(2016)對(duì)蝦夷扇貝()研究發(fā)現(xiàn)，基因在肌肉中表達(dá)量最高。因此，推斷基因在三疣梭子蟹中可能參與多種生理表達(dá)，且因物種的不同其表達(dá)模式具有明顯的差異。

在無(wú)脊椎動(dòng)物中，血細(xì)胞(Wang, 2005; Bachère, 2004; Xiao, 2013)、肝胰腺(Diggles,2000; Wang, 2012)被認(rèn)為是主要的免疫器官，在宿主對(duì)外來(lái)病原體的免疫防御中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步研究基因的功能，本研究對(duì)血細(xì)胞、鰓和肝胰腺3個(gè)組織進(jìn)行了表達(dá)定量分析。研究發(fā)現(xiàn)，在注射副溶血弧菌后，基因在血細(xì)胞、鰓和肝胰腺中的表達(dá)呈現(xiàn)一定程度的下調(diào)表達(dá)(<0.05)，在3 h后，該基因的表達(dá)量呈先上升后下降的模式，而在對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Li, 2015)和近江牡蠣() (Qu, 2016)中研究發(fā)現(xiàn)，基因呈上調(diào)表達(dá)，且在病原感染的過(guò)程中發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)作用，因此，推測(cè)副溶血弧菌導(dǎo)致三疣梭子蟹機(jī)體紊亂，引起基因表達(dá)受到抑制，表明基因參與了三疣梭子蟹免疫防御過(guò)程。WSSV感染后發(fā)現(xiàn)，在所觀察的血細(xì)胞、肝胰腺和鰓中均呈現(xiàn)顯著的上調(diào)表達(dá)(<0.05)，分別在24 h、12 h和48 h達(dá)到最大值，為對(duì)照組的18.21倍、4.9倍和11.68倍，這與凡納濱對(duì)蝦的研究結(jié)果相似：Shi等(2012)的研究證明了該基因具有抑制WSSV復(fù)制的功能，Li等(2015)證明了JNK途徑的激活(包括MKK7/ JNK/AP-1)可以增強(qiáng)抗菌肽(AMPs)的產(chǎn)生。另有研究發(fā)現(xiàn)，在病毒感染過(guò)程中，JNK信號(hào)通路參與病毒復(fù)制和調(diào)控特定病毒蛋白的表達(dá)(Sun, 2018; Li, 2015; Wei, 2015)，而抗菌肽在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中具有重要的作用，這進(jìn)一步證實(shí)了基因在三疣梭子蟹免疫防御過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，本研究首次成功克隆得到三疣梭子蟹的基因序列全長(zhǎng)，并對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行了生物學(xué)分析，通過(guò)病原感染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因在血細(xì)胞、肝胰腺和鰓中的相對(duì)表達(dá)量，初步證實(shí)了基因在三疣梭子蟹感染病原的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，為深入研究基因的功能作用機(jī)制提供了理論參考。

Aoki H, Kang PM, Hampe J,. Direct activation of mitochondrial apoptosis machinery by c-Jun N-terminal kinase in adult cardiac myocytes. Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(12): 10244–10250

Bachère E, Gueguen Y, Gonzalez M,. Insights into the anti-microbial defense of marine invertebrates: The penaeid shrimps and the oyster. Immunological Reviews, 2004, 198(1): 149–168

Bond D, Foley E. A quantitative RNAi screen for JNK modifiers identifies Pvr as a novel regulator ofimmune signaling. PLoS Pathogens, 2009, 5(11): 1000655

Davis RJ. Signal transduction by the JNK group of MAP kinases. Cell, 2000, 103(2): 239

Delaney JR, Stoven S, Uvell H,. Cooperative control ofimmune responses by the JNK and NF-kappaB signaling pathways. EMBO Journal, 2006, 25(13): 3068–3077

Dhanasekaran DN, Reddy EP. JNK signaling in apoptosis. Oncogene, 2008, 27(48): 6245–6251

Diggles BK, Moss GA, Carson J,. Luminous vibriosis in rock lobster(Decapoda: Palinuridae) phyllosoma larvae associated with infection by. Diseases of Aquatic Organisms, 2000, 43(2): 127–137

Huang G, Shi LZ, Chi H. Regulation of JNK and p38 MAPK in the immune system: Signal integration, propagation and termination. Cytokine, 2009, 48(3): 161–169

Jones E, Dickman M, Whitmarsh A. Regulation of p73-mediated apoptosis by c-Jun N-terminal kinase. Biochemical Journal, 2007, 405(3): 617–623

Kyriakis JM, Banerjee P, Nikolakaki E,. The stress- activated protein kinase subfamily of c-Jun kinases. Nature, 1994, 369(6476): 156–160

Li C, Li H, Wang S,. The c-Fos and c-Jun fromplay opposite roles inand white spot syndrome virus infection. Developmental and Comparative Immunology, 2015, 52(1): 26–36

Li L. Common diseases and their control of swimming crab,. Fisheries Science and Technology Information, 2005, 32(6): 269–271 [李盧. 三疣梭子蟹的常見(jiàn)病及其防治. 水產(chǎn)科技情報(bào), 2005, 32(6): 269–271]

Lin A. Activation of the JNK signaling pathway: Breaking the brake on apoptosis. Bioessays News and Reviews in Molecular Cellular and Developmental Biology, 2003, 25(1): 17–24

Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T) method. Methods, 2001, 25(4): 402–408

Minden A, Karin M. Regulation and function of the JNK subgroup of MAP kinases. Letters in Spatial and Resource Sciences, 2008, 1333(2): 85–104

Qu F, Xiang Z, Xiao S,. c-Jun N-terminal kinase (JNK) is involved in immune defense against bacterial infection in. Developmental and Comparative Immunology, 2016, 67: 77–85

Ren HB, Li YB, Zhang XR,. Molecular cloning and sequence analysis offrom. Journal of Biology, 2018, 35(4): 21–24 [任海波, 李燕波, 張肖榮, 等. 三疣梭子蟹抗菌肽基因的克隆與序列分析. 生物學(xué)雜志, 2018, 35(4): 21–24]

Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution, 1987, 4(4): 406–425

Shi GF. The cloning and function research of the genes JNK, C-JUN and ATF-2 in the JNK signaling pathway from shrimp,. Master′s Thesis of Shanghai Ocean University, 2017 [時(shí)恭芳. 斑節(jié)對(duì)蝦JNK信號(hào)通路中的JNK、C-JUN和ATF-2基因的克隆與功能研究. 上海海洋大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2017]

Shi H, Yan X, Ruan L,. A novel JNK frominvolved in white spot syndrome virus infection. Developmental and Comparative Immunology, 2012, 37(3–4): 421–428

Sluss HK, Goberdhan DC, Davis RJ,. A JNK signal transduction pathway that mediates morphogenesis and an immune response inGenes and Development, 1996, 10(21): 2745–2758

Sun J, Li Y, Li M,. A novel JNK is involved in immune response by regulating IL expression in oyster,. Fish and Shellfish Immunology, 2018, 79: 93–101

Sun Y, Zhang L, Zhang M,. Characterization of three mitogen-activated protein kinases (MAPK) genes reveals involvement of ERK and JNK, not p38 in defense against bacterial infection in Yesso scallop. Fish and Shellfish Immunology, 2016, 54: 507–515

Tamura K, Peterson D, Peterson N,. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28(10): 2731–2739

Wang PH, Liang JP, Gu ZH,. Molecular cloning, characterization and expression analysis of two novel Tolls (LvToll2 and LvToll3) and three putative Sp?tzle-like Toll ligands (LvSpz1-3) from. Developmental and Comparative Immunology, 2012, 36(2): 359–371

Wang Y, Puscheck EE, Lewis JJ,. Increases in phosphorylation of SAPK/JNK and p38MAPK correlate negatively with mouse embryo development after culture in different media. Fertility and Sterility, 2005, 83(1): 1144–1154

Wei S, Huang Y, Huang X,. Characterization of c-Jun from orange-spotted grouper,involved in SGIV infection. Fish and Shellfish Immunology, 2015, 1(43): 230–240

Xiao YM, Zhou YH, Xiong Z,. Involvement of JNK in the embryonic development and organogenesis in zebrafish. Marine Biotechnology, 2013, 15(6): 716–725

Yan BL, Liang LG, Zhang XJ. Prevention and cure of fish disease proceedings on main diseases of swimming crab,. Fisheries Science and Technology Information, 2010, 37(1): 29–33 [閻斌倫, 梁利國(guó), 張曉君. 三疣梭子蟹主要病害研究進(jìn)展. 水產(chǎn)科技情報(bào), 2010, 37(1): 29–33]

Zhang J, Lü JJ, Liu P,. Cloning of Toll4 inand its expression in responding to pathogenic infection and low salinity stress. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(2): 146–155 [張杰, 呂建建, 劉萍, 等. 三疣梭子蟹Toll4基因克隆及其在病原和低鹽脅迫中的表達(dá)特征分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(2): 146–155]

Zhang W, Liu HT. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Research, 2002, 12(1): 9–18

Zhou JF, Li XC, Wang JY,Analysis of major infectious diseases and their causative agents ofChinese sea crab. Marine Sciences, 2014, 38(6): 102–106 [周俊芳, 李新蒼, 王江勇, 等. 中國(guó)海水蟹主要流行性疾病及其病原分析. 海洋科學(xué), 2014, 38(6): 102–106]

Zhu YT, Zhang X, Wang SC,Antimicrobial functions of EsLecH, a C-type lectin, via JNK pathway in the Chinese mitten crab,. Developmental and Comparative Immunology, 2016, 61: 225–235

Cloning and Expression Analysis of c-Jun N-Terminal Kinase Gene inafter Pathogenic Stress

ZHANG Yunbin1,3, REN Xianyun2,3, GAO Baoquan2,3, Lü Jianjian2,3WANG Lei1,3, LIU Ping2,3①

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071; 3. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao 266071)

The c-Jun N-terminal kinase (JNK) is a member of the mitogen-activated protein kinase superfamily, which plays an important role in cell proliferation, apoptosis, and immune stress. To further explore the immune defense mechanism of JNK in, the EST sequence ofwas isolated from the transcriptome database of. In this study,the JNK gene of() was successfully cloned by RACE; measurements showed a cDNA length of 3240 bp and an open reading frame of 1380 bp. PtJNKconsists of 459 amino acids, including a serine/threonine protein kinase (S-TKc) domain with a conserved Thr-Pro-Tyr (TPY) motif, which is a typical feature of the JNK gene family. The results of tissue expression and distribution show that thegene is expressed in all tissues. Real-time PCR was used to detect the expression ofunder different pathogenic stimuli. The results show that expression of the gene is significantly down-regulated after injection of(<0.05), while expression is significantly up-regulated when white spot syndrome virus is injected (<0.05). To sum up,gene is a widely expressed gene, and expression of the gene differs according to pathogen.

;; Gene cloning; Pathogenic infection; Quantitative Real-time PCR

LIU Ping, E-mail: liuping@ysfri.ac.cn

S917.4

A

2095-9869(2020)05-0011-09

10.19663/j.issn2095-9869.20190630001

http://www.yykxjz.cn/

張?jiān)茷I, 任憲云, 高保全, 呂建建, 王磊, 劉萍. 三疣梭子蟹C-JUN氨基末端激酶基因克隆及在病原脅迫后的表達(dá)特征分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(5): 92–100

Zhang YB, Ren XY, Gao BQ, Lü JJ, Wang L, Liu P. Cloning and expression analysis of c-Jun N-terminal kinase gene inafter pathogenic stress. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(5): 92–100

* 國(guó)家蝦蟹產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-48)、國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(41576147; 41876186)、泰山領(lǐng)軍人才工程高效生態(tài)農(nóng)業(yè)創(chuàng)新類計(jì)劃項(xiàng)目(LJNY2015002)、江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(面上項(xiàng)目)(BE2017325)和中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(20603022018027)共同資助[This work was supported by the National Shrimp and Crab Industry Technology System (CARS-48), the National Natural Science Foundation of China (41876186; 41576147), the Project of Taishan Scholars Leading Talent (LJNY2015002), the Key Research and Development Plan of Jiangsu Province (BE2017325), and Central Level Public Welfare Research Institutes Basic Research Business Expenses (20603022018027)]. 張?jiān)茷I，E-mail: 930476134@qq.com

劉 萍，研究員，E-mail: liuping@ysfri.ac.cn

2019-6-30,

2019-07-29

(編輯 馮小花)