李 杰,張星星，喬夢(mèng)凡，孟慶玲，喬 軍*，李 妍，王曉婷，李 靜，才學(xué)鵬

(1. 石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

單核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM) 是一種革蘭氏陽(yáng)性胞內(nèi)寄生菌，能夠穿越宿主的血腦屏障、血胎屏障和胃腸屏障[1]，可使新生兒，孕婦和免疫力低下者引起嚴(yán)重的李斯特菌病[2-3]。該菌廣泛存在于土壤表面、腐爛的植物、動(dòng)物糞便等環(huán)境中[4-5]，并能在自然界和高溫、高滲透壓環(huán)境中長(zhǎng)期存活，給人類(lèi)食品安全造成極大威脅[3，6]。

作為一種重要的食源性致病菌，LM可經(jīng)消化道感染，侵入腸上皮細(xì)胞，跨越腸道屏障進(jìn)入機(jī)體引起全身性感染[7-8]，LM入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程極其復(fù)雜，其涉及致病因子、黏附分子、內(nèi)化素等多種蛋白分子[9]。內(nèi)化素位于LM表面，根據(jù)錨定方式的不同可將內(nèi)化素分為四類(lèi)：C端含LPXTG基序共價(jià)錨定在細(xì)胞壁的內(nèi)化素、C端GW基序或WxL基序非共價(jià)錨定在細(xì)胞表面的內(nèi)化素、疏水性尾部蛋白和以分泌形式存在的小內(nèi)化素[10]。其中含有保守LPXTG基序的內(nèi)化素可將蛋白共價(jià)結(jié)合到細(xì)胞壁肽聚糖上，從而參與細(xì)菌感染機(jī)體的過(guò)程，這在致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，LM EGD-e標(biāo)準(zhǔn)菌株含有41個(gè)LPXTG保守基序蛋白，但目前僅有部分蛋白的功能被研究，且部分已被證明與毒力有關(guān)[11]。Lmo0732蛋白是含LPXTG基序的內(nèi)化素蛋白[12]，然而其生物學(xué)功能至今尚不清楚。因此本研究對(duì)含LPXTG基序的內(nèi)化素蛋白Lmo0732進(jìn)行克隆、測(cè)序，并對(duì)分子理化特性及蛋白結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，為深入揭示Lmo0732生物學(xué)功能奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基及試劑

LM SB5菌株從發(fā)病綿羊腦內(nèi)分離并保存；大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)購(gòu)自青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司；DL-2000 DNA Marker、pMD19-T(simple)載體購(gòu)自TaKaRa公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生物公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中l(wèi)mo0732基因序列(登錄號(hào)：NC_003210.1)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增上游引物lmo0732F：5'-CCTCGAGATGAAAAAAGCATTTCTATGC-3'(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物lmo0732R：5'-GGAATTCTCAGCTATGCTTTTGCTTTT-3'(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，引物由北京華大基因公司合成。

1.3 LM lmo0732基因克隆及測(cè)序

按細(xì)菌基因組DNA提取說(shuō)明書(shū)提取LM SB5基因組DNA，以DNA為模板，分別以lmo0732F和lmo0732R為引物擴(kuò)增lmo0732基因，PCR反應(yīng)體系為：H2O 9 μL，PCR Mixture 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min 50 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物在0.5×TBE電泳緩沖液中用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，將目的片段用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收。純化后的PCR產(chǎn)物與pMD19-T(simple)載體過(guò)夜連接，然后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)；通過(guò)菌液PCR進(jìn)一步篩選，將陽(yáng)性克隆送至華大基因生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 Lmo0732蛋白分子特征分析

利用在線軟件ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)，Protscale(http://web.expasy.org/protscale/)分析Lmo0732蛋白質(zhì)的理化特性、親疏水性；根據(jù)在線網(wǎng)址PrositeScan(https://prosite.expasy.org/prosite.html)，(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)，SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)，(http://www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)該蛋白的結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、預(yù)測(cè)信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)等分子特征。

1.5 lmo0732基因遺傳進(jìn)化分析

將LM SB5與15株不同來(lái)源的LM lmo0732基因用DNAStar 7.1和Clustal X 2.1軟件進(jìn)行核苷酸以及推導(dǎo)的氨基酸序列的對(duì)比。利用MEGA 5.0軟件根據(jù)NJ(Neighbor-Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Bootstrap值為1000)，分析不同菌株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 lmo0732基因擴(kuò)增、克隆及測(cè)序

將lmo0732基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)得到約為1 917 bp的目的條帶(圖1)。PCR產(chǎn)物與pMD19-T(simple)載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α后通過(guò)菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆(圖2)，并對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)條帶和預(yù)期大小相符。

2.2 lmo0732基因分子特征分析

lmo0732基因全長(zhǎng)1 917 bp，編碼638個(gè)氨基酸。Motif Scan軟件分析發(fā)現(xiàn)其含有11個(gè)潛在的N聯(lián)-糖基化位點(diǎn)(45-48，77-80，93-96，154-157，176-179，184-187，223-226，229-232，312-315，448-451，534-537)；13個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)(28-31，32-35， 51-54，79-82，172-175，212-215，266-269，357-360，415-418，485-488，502-505，559-562，603-606)；8個(gè)豆蔻?；稽c(diǎn)(187-192，279-284，381-386，399-404，411-416，451-456，498-503，510-515)；10個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(32-34，117-119，145-147，178-180，403-405，421-423，470-472，514-516，536-538，577-579)；1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(472-479)；1個(gè)細(xì)菌Ig-like結(jié)構(gòu)域(471-537)；1個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域(133-152)；2個(gè)MucBP結(jié)構(gòu)域(322-390，396-460)(圖3)。

2.3 Lmo0732蛋白理化特性、跨膜區(qū)及信號(hào)肽分析

ProtParam 軟件分析顯示，該蛋白理論分子質(zhì)量為69.6 kDa，分子式為C3102H4867N797O1004S7，理論等電點(diǎn)為4.58，為酸性蛋白；總疏水性平均數(shù)(GRAVY)為-0.249，屬于親水性蛋白，與ProtScale預(yù)測(cè)親疏水性結(jié)果一致。TMHMM分析發(fā)現(xiàn)，Lmo0732蛋白在氨基酸位置為609～631處存在1個(gè)跨膜區(qū)域。SignalP分析發(fā)現(xiàn)，在其N(xiāo)端1-25氨基酸處存在信號(hào)肽。

2.4 內(nèi)化素之間結(jié)構(gòu)域的比較

將Lmo0732與InlA(lmo0433)、InlB (lmo0434)和InlC(lmo1786) 3個(gè)不同內(nèi)化素進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這4個(gè)內(nèi)化素在N端均有信號(hào)肽和LRR結(jié)構(gòu)域。Lmo0732和InlA均為C端含LPXTG基序的內(nèi)化素，但其結(jié)構(gòu)域存在差異：Lmo0732含有MucBp結(jié)構(gòu)域和Big 3結(jié)構(gòu)域，InlA含有LRR-IR和B重復(fù)結(jié)構(gòu)域；Lmo0732與InlB、InlC均不屬于同一類(lèi)內(nèi)化素，與Lmo0732相比，InlB是C端含有GW基序非共價(jià)錨定在細(xì)胞表面的內(nèi)化素，InlC為分泌性的小內(nèi)化素(圖4)。

2.5 Lmo0732蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋(18.18%)、β-折疊(7.68%)、延伸鏈(27.27%)和無(wú)規(guī)則卷曲(46.87%)組成，因此該蛋白主要以延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲為主；三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明Lmo0732蛋白是由無(wú)規(guī)則卷曲連接多段延伸鏈及α-螺旋所形成的“V”字型結(jié)構(gòu)(圖5)。

2.6 lmo0732基因遺傳進(jìn)化分析

基于lmo0732基因的聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，不同地域的LM分離株可分為2個(gè)基因群，其中意大利，美國(guó)和丹麥等國(guó)家LM臨床分離株(2016TE340、 2018TE5305-1-4、 2015TE34286、2015TE17781-6、2015TE17781-3、FDAARGOS-555、N53-1、SLCC7 179)之間親緣性較近，組成一個(gè)基因群。LM SB5與標(biāo)準(zhǔn)株(LM EGD-e)、加拿大等國(guó)家LM分離株(SLC2372、NC088、01-1468、10-4754、10-5027)之間親緣關(guān)系較近，組成另外一個(gè)基因群，表現(xiàn)出一定的遺傳多樣性(圖6)。

3 討 論

LM被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為僅次于大腸桿菌O157、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌的第四大食源性致病菌，也是必檢的食源性致病菌之一，對(duì)人和動(dòng)物的危害非常嚴(yán)重[13]。在LM細(xì)菌表面蛋白中，含有保守LPXTG基序的內(nèi)化素是病原菌感染機(jī)體過(guò)程中發(fā)揮重要作用的表面蛋白[11]。已有研究表明，LM EGD-e中存在41種帶有LPXTG序列基序的表面蛋白，多于其他G+菌的表面蛋白[10-11]?；蚪M比較發(fā)現(xiàn)，致病LM中約有三分之一的LPXTG蛋白在非致病LM中呈現(xiàn)缺失狀態(tài)[14-15]。在含有LPXTG基序的LM內(nèi)化素蛋白中，有一些與毒力有關(guān)，如 InlA、InlH、InlJ、Lmo2026和Lmo0171等[10，16-17]，而另一些可能對(duì)其在食物或其他環(huán)境中的生存發(fā)揮重要作用[18]，然而還有許多內(nèi)化素至今其生物學(xué)作用尚未研究。

Lmo0732作為L(zhǎng)PXTG基序表面蛋白成員，其具體功能目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，Lmo0732含有2個(gè)MucBP結(jié)構(gòu)域，1個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域和1個(gè)Big 3結(jié)構(gòu)域。其中LRR結(jié)構(gòu)域由22個(gè)氨基酸的串聯(lián)重復(fù)和保守的亮氨酸殘基組成，推測(cè)可能參與蛋白質(zhì)間的相互作用。Big 3結(jié)構(gòu)域?qū)儆贗g-like結(jié)構(gòu)域中的一種，主要通過(guò)與宿主細(xì)胞表面的碳水化合物相互作用從而發(fā)揮粘附作用[10]，推測(cè)LM入侵機(jī)體后該蛋白可能與宿主細(xì)胞的粘附有關(guān)。此外，在LM EGD-e標(biāo)準(zhǔn)株中共有12個(gè)LPXTG蛋白和1個(gè)Lmo0576蛋白中包含MucBP結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域最初在MUB中發(fā)現(xiàn)，以串聯(lián)重復(fù)的方式排列，參與LM對(duì)宿主細(xì)胞的粘附作用[19-20]；在肺炎鏈球菌中，含有MucBP結(jié)構(gòu)域的SP1932蛋白也已被證明通過(guò)與上皮細(xì)胞分泌的粘液相互作用，促進(jìn)其粘附于宿主細(xì)胞[21]；在LM中，Mariscotti等[11]首次證實(shí)LPXTG蛋白Lmo1413的MucBP結(jié)構(gòu)域可以與粘蛋白結(jié)合，提示Lmo0732蛋白可能與細(xì)胞粘附相關(guān)。本研究中Lmo0732有1個(gè)Big 3結(jié)構(gòu)域和2個(gè)MucBP結(jié)構(gòu)域，推測(cè)可能參與粘蛋白的結(jié)合，增加細(xì)菌對(duì)黏液的黏附從而促進(jìn)細(xì)菌粘附在宿主細(xì)胞表面或延長(zhǎng)在腸道內(nèi)的駐留，這在LM侵入機(jī)體過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，LM SB5分離株lmo0732基因含有MucBP和Big 3結(jié)構(gòu)域，推測(cè)可能增強(qiáng)LM入侵過(guò)程中對(duì)機(jī)體的粘附能力；不同地區(qū)分離株可分為2個(gè)基因群，表現(xiàn)出一定的遺傳多樣性。