邢文婷，陳彧，董曉娜，陳培，陳顯臻，趙光麗

（海南省林業(yè)科學(xué)研究院（海南省紅樹林研究院），海南海口571100）

紅冠桉(Corymbia ptychocarpa subsp.aptycha)，又名皺果桉，桃金娘科桉屬，原生地為澳大利亞西澳、北澳和昆士蘭州，因其獨特的葉形和優(yōu)美的終端花序被作為景觀植物引進中國，是一種近年來被引進推廣的新興觀賞類中等喬木[1]。其樹高8m～10m，花色為白色、粉紅色至緋紅色，3a～4a 開花，為優(yōu)良的觀花桉樹屬植物[2-4]。在海南引種地，20 年生樹干胸徑一般為13cm～15cm，嫩葉、新葉、老葉顏色各異，葉形為長矛形，葉長25cm、寬7cm；圓錐花序頂生，直徑達7cm，花朵位于側(cè)枝頂端，觀花期長，引種地花期為8 月至次年1 月，是優(yōu)良的觀花桉樹屬植物。在凋謝期若無外力大搖晃，花瓣凋落慢，離體干花花色與鮮花顏色無差異，是鮮切花的優(yōu)良材料。紅冠桉果實為蒴果，形似蓮蓬，種殼木質(zhì)化程度較高，種子取出非常困難，且種子空癟率高，多不發(fā)芽或發(fā)芽率低[5-6]。雖然在中國福建、廣東、海南地區(qū)先前已有少量的紅冠桉成功引種馴化，但因種子進口成本高，紅冠桉種苗的培育和推廣應(yīng)用受到嚴(yán)重制約[4，7]。因此，通過器官發(fā)生途徑建立紅冠桉組織培養(yǎng)再生體系不僅能夠使親本的優(yōu)良性狀穩(wěn)定遺傳，且有利于優(yōu)良無性系苗木的規(guī)?；a(chǎn)[8]。

增殖、生根培養(yǎng)是植物組織實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟。芽增殖常見以莖段為外植體誘導(dǎo)腋芽，通常有兩種方式，一種是莖段先誘導(dǎo)腋芽，再用腋芽增殖叢生芽；另外一種是將誘導(dǎo)腋芽與叢生芽增殖合為一步[9]。生根須經(jīng)過外界物理或化學(xué)因素的刺激才能誘導(dǎo)產(chǎn)生根原基，根原基由皮部直接形成，或先形成愈傷組織后再產(chǎn)生根原基[4，10-11]。土豆、香蕉、椰子水均是容易獲取的天然有機物，因其成本低而適合應(yīng)用于工廠化育苗。目前國內(nèi)外有關(guān)木本花卉紅冠桉組織培養(yǎng)已有研究報道[1，5，8]，關(guān)于天然有機物及其添加量對其組織培養(yǎng)影響的研究尚未見報道。研究以在海南成功馴化的8 年生紅冠桉枝條莖段為試驗材料，采用上述第一種芽增殖途徑，研究不同天然有機物對腋芽誘導(dǎo)、增殖、生根效果，篩選利于芽增殖、生根及長勢良好的最佳天然有機物及其添加量，為推廣木本花卉紅冠桉快繁體系及工廠化育苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗材料為在海南成功引種馴化的8 年生母樹紅冠桉枝條莖段。

1.2 試驗方法

1.2.1 采用不同土豆劑量試驗

通過修剪法復(fù)壯成年樹枝條，采集預(yù)處理的紅冠桉待萌芽枝條，取頂端第二節(jié)間、半木質(zhì)化莖段，自來水沖洗10min，在超凈臺上剪取長3cm～4cm 節(jié)間莖段，無菌水浸泡1min，用70%酒精消毒30s，0.1%升汞浸泡10min，無菌水沖洗5～6 次。切取2cm 左右?guī)Ч?jié)間莖段，接種于含不同土豆劑量(0g·L-1，10 g·L-1，20g·L-1) 和6-BA 0.5mg·L-1的MS培養(yǎng)基(各培養(yǎng)基中均含30g·L-1白糖和8g·L-1卡拉膠，pH5.8，經(jīng)121℃高壓滅菌20min)中，每瓶接種1個待萌芽莖段，每個處理接種35 瓶。以組培白熾燈為光源，暗培養(yǎng)10d，后每天12h 光照/12h 黑暗，光照強度為1500lx～2500lx，培養(yǎng)溫度28℃±2℃，45d 內(nèi)觀察并統(tǒng)計腋芽平均萌發(fā)率和萌芽系數(shù)。

莖段腋芽萌發(fā)率[4]= (萌發(fā)腋芽的莖段數(shù)/接種的莖段總數(shù)) ×100%；萌芽系數(shù)=（萌芽總數(shù)/萌芽莖段的總數(shù)）×100%）。

1.2.2 采用不同天然有機物試驗

以MS+6-BA 1.0mg·L-1+ZT 1.0mg·L-1為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH 值5.8；以添加不同天然有機物（土豆、香蕉、椰子水）為處理，分別進行單因素3 水平試驗。土豆劑量水平為10g·L-1、20g·L-1、30g·L-1；香蕉劑量水平為10g·L-1、20g·L-1、30g·L-1；新鮮椰子水含量為10%/L、20%/L、30%/L。將已獲得的簇狀叢生芽切成體積約0.5cm3的若干小塊，分別接種于上述3 種有機物不同劑量培養(yǎng)基中，每瓶3 塊芽簇，每個處理12瓶，3 次重復(fù)。培養(yǎng)45d 后觀察叢芽的生長情況及統(tǒng)計增殖系數(shù)和叢芽高度。

以 MS+6-BA 0.8mg·L-1+IBA 0.04mg·L-1+ZT 0.03mg·L-1為基本培養(yǎng)基，pH 值5.8。以新鮮椰子水為處理因素，設(shè)計單因素7 水平1%、2%、3%、5%、10%、15%、20%試驗，將已獲得的叢生芽切成3～6 個芽叢，接種于上述不同椰子水含量的1L 培養(yǎng)基中。培養(yǎng)30d 后觀察叢芽長勢及統(tǒng)計其叢芽高度和展葉數(shù)。

平均增殖系數(shù)=培養(yǎng)所得的芽總數(shù)/接種的芽總數(shù)；芽平均高度=芽高度總和/接種的芽總數(shù)[2]。

1.2.3 采用椰子水試驗

將單芽切離叢生芽，以零添加MS 基本培養(yǎng)基為對照，以分別添加10%/L、15%/L、20%/L 新鮮椰子水為空白試驗。在無外源激素互作下培養(yǎng)30d，觀察椰子水對單芽嫩莖生長勢及生根的影響。

根據(jù)前期試驗結(jié)果，以MS+0.5mg·L-1IBA+0.2mg·L-1NAA，pH 值5.8 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；依據(jù)上述空白試驗結(jié)果，設(shè)定1%、3%、5%、10%、15%、20%椰子水含量，并分別添加于上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20d 后觀察椰子水與外源激素互作對紅冠桉組培苗生根及長勢的影響。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)分別采用Excel 和SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計處理及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土豆對腋芽萌發(fā)的影響

如表1 所示，不同土豆劑量分別添加于MS+6-BA 0.5mg·L-1培養(yǎng)基中，土豆劑量增加，腋芽萌發(fā)率下降，不同處理結(jié)果差異明顯；土豆劑量為0g·L-1時，腋芽萌發(fā)率最高，達97.1%；說明添加土豆未能促進紅冠桉莖段腋芽啟動反而可能使培養(yǎng)基中細胞分裂素濃度提高而出現(xiàn)負(fù)調(diào)節(jié)作用。

表1 不同土豆劑量對紅冠桉腋芽啟動萌發(fā)的影響Tab.1 Effects of different potato content on axillary buds germination from Corymbia ptychocarpa in MS medium(means ± SE)[4]

2.2 不同天然有機物對芽增殖、生長的影響

在MS+6-BA 1.0mg·L-1+ZT 1.0mg·L-1培養(yǎng)基中添加3 種不同天然有機物，結(jié)果顯示，添加3 種有機物的培養(yǎng)基芽增殖系數(shù)均較對照組提高；其中以添加椰子水的培養(yǎng)基芽增殖系數(shù)和高度最大，其次是添加香蕉的培養(yǎng)基芽增殖系數(shù)，但芽高度均與對照無差異；添加土豆的培養(yǎng)基對芽增殖系數(shù)和高度與對照無顯著差異；各天然有機物濃度梯度之間，芽增殖系數(shù)和高度均無顯著差異（表2）。根據(jù)試驗結(jié)果，初步以10%椰子水含量作為促進芽增殖、健壯生長的最適天然有機物。

以10%椰子水含量為試驗上限值。如表3 所示，隨著培養(yǎng)基中椰子水含量增加，叢生芽生長勢受到抑制，當(dāng)椰子水含量為2%·L-1時，叢芽長勢最強，莖稈粗壯而質(zhì)硬，壯苗數(shù)、展葉數(shù)和叢芽高度達到最大值。說明培養(yǎng)基中低含量的椰子水促進叢生芽生長發(fā)育，高含量的椰子水使叢生芽的生長勢受限制。

表2 不同天然有機物對紅冠桉不定芽增殖生長的影響Tab.2 The effect of different NOM on adventitious bud proliferation coefficient of Corymbia ptychocarpa

表3 不同椰子水含量培養(yǎng)基中叢生芽生長勢的比較Tab.3 Comparison of growth vigor of clump shoot in different coconuts content culture medium

2.3 椰子水對單芽生長勢及生根的影響

在MS 培養(yǎng)基中僅添加不同劑量椰子水。試驗表明，在未添加椰子水的MS 基本培養(yǎng)基中，單芽黃化，嫩莖壞死，生長勢較差，展葉數(shù)和生根數(shù)均為0；在添加椰子水的培養(yǎng)基中單芽生長勢較對照好，存活數(shù)、展葉數(shù)和生根數(shù)均有明顯差異，每芽生根條數(shù)為1（表4）。說明椰子水對芽長勢及生根有一定的促進作用。

表4 不同椰子水含量對單芽生長勢的影響Tab.4 Effects of different coconuts content on growth vigor of per shoot

如表5 所示，對照組生根率、每株根條數(shù)最高，但根系長度較短，根系灰色易斷。經(jīng)添加不同劑量椰子水的處理，嫩莖生根較對照延遲，生根率、生根條數(shù)均低于對照組。另外，在6 個處理水平中，以1%椰子水劑量生根率最高；當(dāng)椰子水劑量增加時，雖然生根率受抑制，但根系生長逐漸增強，以添加10%椰子水培養(yǎng)基的嫩莖的根長最長；各水平間每株根條數(shù)和生長勢差異不明顯，根系呈白偏黃，生長健壯，莖稈粗壯。說明促進單芽生根的關(guān)鍵因子是植物生長素，而椰子水則促進芽長勢及根伸長，對生根率作用較小。

表5 不同椰子水含量對生根指標(biāo)的影響Tab.5 Effects of different coconuts content on rooting indexes

3 討論與結(jié)論

目前，天然有機物對植物組織培養(yǎng)的作用主要在草本植物組培中研究報道較多，應(yīng)用于木本樹種組織培養(yǎng)研究中甚少，多數(shù)以植物激素對其組織培養(yǎng)的影響研究為主。該研究采用多因子多水平試驗，通過添加3 種天然有機物不同濃度梯度，觀察紅冠桉腋芽啟動、芽增殖和生根及長勢的變化情況，逐級分析天然有機物對紅冠桉莖段腋芽誘導(dǎo)、增殖、生根的影響。試驗結(jié)果表明，在腋芽誘導(dǎo)階段，添加土豆的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中腋芽萌發(fā)率較未添加土豆的對照低；在芽增殖培養(yǎng)階段，3 種天然有機物對芽增殖系數(shù)和生長差異的影響，以添加椰子水培養(yǎng)基中芽增殖系數(shù)和高度最高，且高于未添加椰子水的對照；其次是添加香蕉的培養(yǎng)基中芽增殖系數(shù)較未添加香蕉的對照高，但其芽高度和生長勢及添加土豆的培養(yǎng)基中芽增殖系數(shù)和叢芽高度與對照無顯著差異。以10%椰子水劑量為添加量上限值，當(dāng)添加椰子水劑量為2%·L-1時，叢芽長勢最強。由于在僅添加椰子水的MS 基本培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)，椰子水對嫩莖生根及長勢有一定的促進作用，因此在對照MS+0.5mg·L-1IBA+0.2mg·L-1培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別添加6 個不同劑量椰子水試驗表明，生根率以未添加椰子水的對照最高；其次是添加1%椰子水的培養(yǎng)基，添加10%椰子水的培養(yǎng)基中嫩莖的根長最長，單芽根系呈白偏黃，生長健壯，莖稈粗壯。綜上所述，說明天然有機物對芽長勢及根伸長有較大的促進作用，而生根率效果不及未添加有機物的對照。這一結(jié)果與寧昭然等對黑木相思生根技術(shù)的研究結(jié)論一致[13]。