每個生物體中遺傳信息的變異性是生態(tài)系統(tǒng)中廣泛生物多樣性的基礎(chǔ)。除了簡單的突變導(dǎo)致一個或多個堿基的改變外，在不同物種的進化過程中還可以反復(fù)觀察到染色體結(jié)構(gòu)的變化。特別是染色體片段方向的改變（例如倒位），與物種形成、適應(yīng)和基因組進化有關(guān)。染色體倒位是在不同的植物分離株或品種之間反復(fù)發(fā)生的重排。這種倒位可能是進化中生殖隔離的基礎(chǔ)，也是經(jīng)典育種的一個主要障礙，因為在同源染色體上的倒位序列之間無法觀察到交叉（crossovers，COs）。

近日，德國卡爾斯魯厄理工學(xué)院的Holger Puchta團隊在Nature Communications上發(fā)表了題為“Changing local recombination patterns in Arabidopsis by CRISPR/Cas mediated chromosome engineering”的研究成果，描述了Col-0中hk4S倒位的逆轉(zhuǎn)，并利用來自金黃色葡萄球菌的高效Cas9核酸酶在各自區(qū)域的品種之間恢復(fù)CO。

通過比較兩個擬南芥生態(tài)型Columbia（Col-0）和Landsberg errecta（Ler-1）的基因組序列，可以檢測到許多倒位。其中最著名的是hk4S倒位，大小為1.17Mb，導(dǎo)致著絲粒異染色質(zhì)knob區(qū)域轉(zhuǎn)移至4號染色體短臂的中間。而Ler-1中的4號染色體代表進化較早的構(gòu)象，Col-0對應(yīng)的4號染色體帶有hk4S倒位。

首先，作者利用現(xiàn)有的序列信息識別了合適的原間隔序列，這些序列位于兩個原始反轉(zhuǎn)結(jié)附近。此外，為了避免周圍基因的干擾，確保了所選的原間隔區(qū)位于基因間區(qū)域（根據(jù)其對著絲粒的定位，命名為近端原間隔區(qū)（p PS）和遠端原間隔區(qū)（d PS））。所用的兩個原間隔區(qū)都被放置在靠近原始hk4S d結(jié)的kb范圍內(nèi)。在卵細胞特異性EC1.1/EC1.2啟動子的控制下，用Sa-Cas9克隆到pDe-Sa-Cas9載體中，最終轉(zhuǎn)化為A.thaliana Col-0野生型植物。并通過對38個初級轉(zhuǎn)化子代的篩選，作者獲得了7個獨立的Mb大小的倒位事件，總的頻率約為0.5%，成功地實現(xiàn)了hk4S knob的倒轉(zhuǎn)。

接下來，作者測試了是否能夠通過CRISPR/Cas誘導(dǎo)的hk4S knob倒位來重新激活與Ler-1雜交的先前CO區(qū)的重組。作者將Ler-1與rknob-1雜交，并用Col-0野生型植物與Ler-1雜交作為對照。重組頻率利用SNP的基因分型，通過使用七個標(biāo)記來區(qū)分Col-0和Ler-1來確定。標(biāo)記2和標(biāo)記6位于倒位的外部，但直接靠近倒位連接處，距離只有幾百個堿基對，代表倒位的兩個邊界。

首先，作者分析了倒位區(qū)的單倍體花粉。在開花期收集雜種F1的花序，通過流式細胞儀分離花粉核，進行全基因組擴增。作為質(zhì)量控制，作者檢測了3個不同區(qū)域是否存在SNP標(biāo)記，以識別成功擴增的花粉DNA。然后，確定了5個間隔的CO頻率。在倒位線的54個樣本（rknob-1×Ler-1）中，作者檢測到3個均勻分布在倒位區(qū)域上的獨立CO事件，而在90個對照樣本中，沒有在倒位區(qū)域內(nèi)檢測到CO事件。為了證實后代的這些結(jié)果，作者利用SNP的基因分型測試了6株雜種F2植株的CO形成。用與F1分析相同的引物和探針對rknob-1×Ler-1系198株F2和對照組200株F2植株測定了CO。總體而言，作者在rknob-1×Ler-1系的染色體臂中檢測到9個CO事件，在倒位中檢測到27個CO事件，在著絲粒附近沒有CO事件。因此證明，通過恢復(fù)knob倒位，作者恢復(fù)了4號染色體先前不可接近部分的CO形成，并改變了重組模式。

本文研究表明，利用金黃色葡萄球菌中Cas9核酸酶的卵細胞特異性表達，可以實現(xiàn)1.1Mb長hk4S倒位的靶向逆轉(zhuǎn)。通過將帶有重排的4號染色體的Col-0與Ler-1雜交，減數(shù)分裂交換可以恢復(fù)到以前沒有檢測到的遺傳交換的區(qū)域。昭示了打破遺傳連鎖的體細胞染色體工程策略在植物育種中具有巨大的應(yīng)用潛力。