李莉，鄭璇，張曉嶺，鄒家素

（重慶市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，重慶 401147）

氯霉素類抗生素主要包括氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜氯霉素，它們能與細(xì)菌核糖體結(jié)合，干擾蛋白質(zhì)合成而抑制細(xì)菌生成。氯霉素作為第一個(gè)人工合成的抗菌藥物，表現(xiàn)出廣譜的抗菌能力；甲砜霉素為氯霉素苯環(huán)上的硝基被一甲砜基取代后的產(chǎn)物，體內(nèi)抗菌活性比氯霉素更強(qiáng)，水溶性和穩(wěn)定性比氯霉素更高，是氯霉素類的第二代廣譜抗菌藥；氟甲砜霉素是甲砜霉素的單氟衍生物，對(duì)甲砜霉素和氯霉素耐藥的菌株仍對(duì)氟甲砜霉素敏感。氟甲砜霉素的抗菌譜與抗菌活性略優(yōu)于氯霉素和甲砜霉素，是氯霉素類的第三代廣譜抗菌藥［1–3］。

氯霉素類抗生素被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜禽養(yǎng)殖中，但氯霉素類抗生素對(duì)人體造血功能有較大損害，因而威脅人類的健康，歐盟、美國(guó)等國(guó)家和地區(qū)先后將其列為禁用藥物［4–5］。隨著畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，我國(guó)抗生素的種類和用量的日益增加，人類和動(dòng)物所使用的大部分抗生素類藥物未經(jīng)代謝便通過(guò)糞便或者尿液排出體外，進(jìn)入環(huán)境，對(duì)地下水和地表水體造成一定程度的污染，進(jìn)而影響人類的飲用水安全［6］。為適應(yīng)新時(shí)期環(huán)境保護(hù)的需要，開(kāi)展水環(huán)境中氯霉素殘留的檢測(cè)研究具有非常重要的意義。

高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC–MS／MS）法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于氯霉素殘留的分析［7–9］。牛奶、雞蛋、肉制品、水產(chǎn)品等食品都建立了利用該方法測(cè)定氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)［10–14］，但水中抗生素的測(cè)定研究尚在起步階段［15］，測(cè)定方法多為多類抗生素混合測(cè)定，或目標(biāo)物為單一氯霉素。筆者利用固相萃?。⊿PE）對(duì)樣品進(jìn)行濃縮凈化，結(jié)合LC–MS／MS 分析技術(shù)，以氯霉素–D5 為內(nèi)標(biāo)，對(duì)樣品萃取劑的流量、固相萃取洗脫溶劑、液相分離流動(dòng)相、質(zhì)譜條件等方面進(jìn)行探討和試驗(yàn)，并確定了樣品保存時(shí)間，建立了一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確地同時(shí)定量檢測(cè)水環(huán)境中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜氯霉素3 種抗生素殘留的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜儀：TSQ ACCESS 型，美國(guó)Thermo Scientific 公司；

固相萃取柱：Oasis HLB 型，6 mL／150 mg，美國(guó)Waters 公司，使用前需分別用10 mL 甲醇和10 mL 超純水活化；

濾膜：孔徑為0.2μm，親水性聚丙烯（GHP）針式微孔濾膜；

甲醇：農(nóng)殘級(jí)，韓國(guó)Duskan Minchem Corp 公司；

乙酸銨–甲醇溶液：取80 mL 乙酸銨溶液（5 mmol／L）與20 mL 甲醇混合；

氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度分別為98.5%，99.0%，99.8%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司；

氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 ng／μL，介質(zhì)為乙腈，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司；

氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：質(zhì)量濃度均為1.00 mg／mL，取對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用甲醇溶解定容制得；

氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的質(zhì)量濃度均為100 μg／mL，取氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，混合，用甲醇稀釋制得；

氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的質(zhì)量濃度均為1.0～100 μg／L，取對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液及氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液適量（作為內(nèi)標(biāo)物），用甲醇稀釋制得；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 樣品前處理

水樣經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，取1 000 mL 濾液，調(diào)節(jié)pH 至4～7，用固相萃取柱進(jìn)行富集萃取。水樣以低于10 mL／min 的流量通過(guò)HLB 小柱，待全部樣品過(guò)柱后，用10 mL 超純水淋洗小柱，用氮?dú)獯蹈桑儆?0 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液于潔凈試管中，在氮?dú)鉂饪s儀上吹至近干，然后用乙酸銨–甲醇溶液定容至1 mL，加入氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 μL 作為內(nèi)標(biāo)，經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾，置于樣品瓶中，待測(cè)。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 液相色譜

色譜柱：Thermo C18液相色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國(guó)Thermo Scientific 公司）；進(jìn)樣體積：10μL；流動(dòng)相：5 mmol／L 乙酸銨溶液–甲醇，流量為250 μL／min，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜

電噴霧：負(fù)離子模式（ESI–）；離子傳輸毛細(xì)管溫度：350℃；氣化室溫度：200℃；鞘氣：氮?dú)?，壓力?.5 MPa；輔助氣：氮?dú)?，壓力?.5 MPa；噴霧電壓：3 000 V；監(jiān)測(cè)模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）；碰撞氣：氬氣，壓力為200 Pa。3 種抗生素的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 3 種抗生素的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 離子源極性的選擇

分別采用電噴霧電離源（ESI）的正離子和負(fù)離子模式，上機(jī)檢測(cè)組分質(zhì)量濃度均為100 μg／L 的氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（含內(nèi)標(biāo)氯霉素-D5100 μg／L），發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，各化合物均無(wú)明顯出峰，且響應(yīng)值均遠(yuǎn)小于負(fù)離子模式，而在負(fù)離子模式下3 類目標(biāo)物分離很好，如圖1。氯霉素類抗生素均含有酚羥基和氯原子，具有較強(qiáng)的電負(fù)性，故應(yīng)采用負(fù)離子模式檢測(cè)。

圖1 3 種抗生素的SRM 色譜圖

2.2 流動(dòng)相的選擇

分別以5 mmol／L 乙酸銨溶液–甲醇、甲醇–水、甲醇–0.05%甲酸溶液為流動(dòng)相，采用相同的梯度洗脫程序，分析組分質(zhì)量濃度均為100 μg／L 的氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（含內(nèi)標(biāo)氯霉素-D5100μg／L），實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以甲醇–0.05%甲酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，3 種物質(zhì)分離不完全；以5 mmol／L 乙酸銨溶液–甲醇為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰形比以甲醇–水為流動(dòng)相時(shí)要好。因此以5 mmol／L乙酸銨溶液–甲醇為流動(dòng)相。

2.3 固相萃取條件的選擇

2.3.1 水樣pH 值

有文獻(xiàn)報(bào)道固相萃取時(shí)調(diào)節(jié)水樣的pH 值至4.0時(shí)，氯霉素類抗生素可得到滿意的回收率［4］，故進(jìn)行了如下試驗(yàn)：分別配制pH 值為4.0，6.0，7.0，8.0，10.0 的空白加標(biāo)樣品，按1.2 方法進(jìn)行樣品前處理后上機(jī)測(cè)試。平行測(cè)定3 次，計(jì)算抗生素的平均加標(biāo)回收率，不同pH 條件下抗生素的回收率如圖2所示。結(jié)果表明，當(dāng)pH 為4.0～7.0 時(shí)，樣品加標(biāo)回收率穩(wěn)定在80%左右，變化不大，但當(dāng)pH ＞7.0 時(shí)，樣品加標(biāo)回收率明顯降低。因此適宜的水樣pH 值為4～7。不需要將水樣的pH 特別調(diào)至酸性。

圖2 水樣不同的pH 值對(duì)應(yīng)的抗生素回收率

2.3.2 樣品萃取的流量

水樣經(jīng)過(guò)萃取小柱的流量直接影響小柱對(duì)目標(biāo)化合物的富集效率。試驗(yàn)考察了樣品流量分別為2，5，10 mL／min 時(shí)空白加標(biāo)樣品的回收率，結(jié)果如圖3 所示。結(jié)果表明，3 種樣品流量的抗生素加標(biāo)回收率均在87%～125%范圍，滿足樣品測(cè)定要求?？紤]到提高分析效率的因素，選取樣品萃取流量為10 mL／min。

圖3 樣品萃取不同流量時(shí)抗生素的回收率

2.3.3 淋洗液pH 值的影響

配制10 ng／L 的空白加標(biāo)溶液，分別采用pH 7 和pH 2.0 的去離子水作為淋洗液，測(cè)定不同淋洗液pH 值對(duì)應(yīng)的抗生素回收率，測(cè)定結(jié)果如圖4 所示。由圖4 可知，淋洗液的pH 值對(duì)樣品種抗生素的回收率影響不大。實(shí)驗(yàn)選擇pH 7 的去離子水作為淋洗液。

圖4 不同淋洗液pH 值對(duì)應(yīng)的抗生素回收率

2.3.4 洗脫液的選擇

分別選取10 mL 甲醇、10 mL 2%甲酸溶液–甲醇和10 ml 1%氨水–甲醇為洗脫液進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算3 種洗脫液對(duì)應(yīng)的抗生素回收率，結(jié)果如圖5 所示。試驗(yàn)表明，10 mL 2%甲酸–甲醇作為洗脫液時(shí)，抗生素回收率顯著降低，10 mL 甲醇作為洗脫液時(shí)加標(biāo)回收率最優(yōu)，故選擇10 mL 甲醇作為洗脫液。

圖5 洗脫液的種類對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

2.4 線性關(guān)系

配制質(zhì)量濃度分別為1.0，2.0，10.0，20.0，50.0，100.0 μg／L 的氯霉素類抗生素系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（其中內(nèi)標(biāo)氯霉素-D5的質(zhì)量濃度均為50.0 μg／L），在設(shè)定的色譜條件下，由低濃度到高濃度依次對(duì)上述溶液進(jìn)行測(cè)定，以系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中目標(biāo)組分的質(zhì)量濃度為自變量，以對(duì)應(yīng)的色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)物色譜峰面積的比值和內(nèi)標(biāo)物濃度的乘積為因變量，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。3 種抗生素的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)列于表3。由表3 可知，3 種抗生素的質(zhì)量濃度在1.0～100.0 μg／L 范圍線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.993 5～0.997 7。

表3 種氯霉素類抗生素的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)

2.5 檢出限及測(cè)定下限

按照HJ 168–2010 空白實(shí)驗(yàn)中未檢出目標(biāo)物質(zhì)的檢出限測(cè)定方法，配制7 份1 000 mL 3 ng／L平行水樣，按樣品測(cè)定的全過(guò)程進(jìn)行分析，得3 種抗生素的檢出限為1.04～1.33 ng／L，測(cè)定下限為4.16～5.32 ng／L。

2.6 精密度試驗(yàn)

分別配制5，10.0，20.0 μg／L 的空白加標(biāo)樣品各6 份，按1.2 進(jìn)行樣品前處理，上機(jī)分析，測(cè)定結(jié)果列于表4。由表4 可知，3 種抗生素3 水平加標(biāo)測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍3.0%～11.1%，本方法精密度滿足分析要求。

表4 空白樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

選取地表水、廢水樣品，加入氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至質(zhì)量濃度均分別為5，10 ng／L 和10，20 ng／L，配制加標(biāo)樣品各6 份，按1.2 進(jìn)行樣品前處理，上機(jī)分析，測(cè)定結(jié)果列于表5。由表5 可知，3 種抗生素的樣品加標(biāo)回收率為101%～123%，該法準(zhǔn)確度滿足分析要求。

表5 實(shí)際樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品保存時(shí)間

吸取1.00 mg／L 氯霉素類使用液20 μL，用水定容至1.00 mL，分別置于棕色玻璃小瓶中，分別考察其在4℃冷藏條件下，存放1，2，4，7，14 d 后測(cè)定值的變化。結(jié)果表明，在14 d 內(nèi)避光冷藏條件下，氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜氯霉素的濃度均無(wú)顯著變化，因此，樣品應(yīng)采用0～4℃避光保存，于14 d 內(nèi)分析完畢。

3 結(jié)語(yǔ)

采用固相萃取與高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了同時(shí)測(cè)定水體中3 中氯霉素類抗生素的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法線性良好，檢出限較低，精密度、準(zhǔn)確度滿足分析要求，可應(yīng)用于實(shí)際水樣中氯霉素類抗生素殘留的檢測(cè)。