馮靜，陳曦，曹忠波，邢立瑩，李延升，謝韜

（遼寧省疾病預防控制中心，遼寧省空氣霧霾與人群健康監(jiān)測重點實驗室，沈陽 110005）

1999 年，英國帝國理工大學的Nicholson 等首次提出“代謝組學”的概念，他們通過高分辨核磁共振技術(shù)首次整體繪制了生物體液的代謝物指紋圖譜，并將這種分組分析的方法稱為代謝組學，此番論述開創(chuàng)了對復雜樣品進行代謝組學分析的先河［1–3］。發(fā)展到近代，代謝輪廓分析已進化為代謝組學研究并且廣泛應(yīng)用于血、尿、腦脊液等生物樣品中代謝物的定性與定量分析，以對疾病進行篩選和診斷［4–8］。代謝組學正日益成為生命科學研究的重點之一。針對慢性病基礎(chǔ)調(diào)查進一步開展相關(guān)的代謝組學研究一直是筆者近年的工作內(nèi)容［9–10］。由于代謝產(chǎn)物和生物體系的復雜性，尚未發(fā)展出能完全滿足代謝組學分析的技術(shù)。

目前聯(lián)用技術(shù)和多方法綜合分析是公認的先進手段，其中色譜–質(zhì)譜聯(lián)用方法因兼具色譜的高分離度、高通量及質(zhì)譜的普適性、高靈敏度和特異性而成為最主要的分析工具［11–14］。代謝組學研究包括樣品采集和制備、代謝組數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)預處理、多變量數(shù)據(jù)分析、標志物識別和途徑分析（代謝通路分析），結(jié)合臨床疾病篩查診斷需要，可進一步篩選變量，繪制受試者工作特征分析曲線(ROC)，建立邏輯分析概率模型，可望應(yīng)用于未知人群疾病的篩查［5，15–17］。作為代謝組學研究的初始步驟，樣品和數(shù)據(jù)采集是分析過程中最重要的環(huán)節(jié)之一，但目前發(fā)表的文獻中此步驟往往沒有經(jīng)過充分的討論。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，提取劑、色譜條件甚至是檢測儀器不同均會使代謝物小分子的檢出數(shù)量產(chǎn)生顯著差異。而盡可能獲得最大的代謝物覆蓋是非靶向代謝組學研究的基礎(chǔ)，為保證后續(xù)數(shù)據(jù)的全面性和準確性以建立最可靠的預測模型，筆者對樣品及數(shù)據(jù)采集方法做了全面的驗證，以建立人血漿中非靶向代謝組學檢測的最優(yōu)方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜系統(tǒng)：Waters AcquityTMUPLC system型，美國沃特世公司；

質(zhì)譜儀：Xevo TQ 型三重四級桿質(zhì)譜儀，美國沃特世公司；

代謝組學軟件：Markerlynx 4.1，美國沃特世公司；

高速冷凍離心機：Thermo ST16R 型，美國賽默飛世爾科技公司；

氮吹儀：TurboVap LV 型，美國Caliper Life Sciences 公司；

漩渦混合器：Vortex-genie2 型，美國Scientific Industries 公司；

乙腈、甲醇、乙醇、丙酮：均為色譜純，美國賽默飛世爾科技公司；

甲酸：色譜純，美國Sigma 公司；

2-氯-苯丙氨酸標準品：純度為98%，標準物質(zhì)編號為LLB0T93，河北百靈威超精細材料有限公司；

實驗用水：超純水，自制。

1.2 溶液的配制

內(nèi)標儲備液：準確稱取2-氯-苯丙氨酸標準品100 mg 于10 mL 容量瓶中，以1%甲酸溶液–乙腈（40∶60）溶解并定容，得2-氯-苯丙氨酸質(zhì)量濃度為10 mg／mL 的內(nèi)標儲備液。

含內(nèi)標復溶溶液：取100 μL 內(nèi)標儲備液于10 mL 容量瓶中，以乙腈–水（1∶4）定容，得2-氯-苯丙氨酸質(zhì)量濃度為0.1 mg／mL 的復溶溶液。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜

色譜柱：Waters Acquity Hss T3 柱（100 mm× 2.1 mm，1.8 μm，美國沃特世公司）；柱溫：50℃；樣品室溫度：4 ℃；進樣體積：10 μL；流動相：0.1%甲酸水溶液–0.1%甲酸乙腈溶液，流量為0.3 mL／min；梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜分離梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜

離子源：電噴霧離子源（ESI）；監(jiān)測模式：正離子模式；脫溶劑氣：氮氣，流量為650 L／h；離子源溫度：150℃；錐孔反吹氣：氮氣，流量為50 L／h； 脫溶劑氣溫度：350℃；毛細管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：30 V；質(zhì)量測定：NaI–CsI；質(zhì)量掃描范圍：100～1 000 Da。

1.4 生物樣品制備

血漿樣品的采集：采集4 名健康志愿者全血各10 mL 于EDTA 抗凝采血管中，渦旋混合，以3 500 r／min 轉(zhuǎn)速離心6 min，分離，得上層血漿樣品，分裝成a，b，c 3 份，每份700 μL，于–80℃保存。

血漿質(zhì)控樣品的制備：分別準確吸取每份血漿樣品200 μL，渦旋混合，得血漿質(zhì)控樣品，分裝成a，b，c 3 份，每份800 μL，于–80℃保存。

血漿樣品的預處理：取血漿100 μL，加入甲醇–丙酮（1∶1） 300 μL，渦旋10 s，于4 ℃下以13 000 r／min 轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清液于2 mL離心管中，于室溫下用氮氣吹干，加入300 μL 含內(nèi)標復溶溶液復溶，過0.22 μL 濾膜，取10 μL 注入超高效液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀中進行分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

將樣品測定值用代謝組學軟件Markerlynx 4.1進行數(shù)據(jù)處理，軟件對儀器采集的數(shù)據(jù)進行解卷集和峰提取，獲取每個血漿樣品中的代謝物檢測數(shù)量、保留時間和質(zhì)荷比，數(shù)據(jù)可以導入第三方多元統(tǒng)計分析軟件中進行進一步處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 代謝物提取條件篩選優(yōu)化

查閱文獻發(fā)現(xiàn)，乙腈、甲醇–乙腈混合液、甲醇–丙酮混合液作為提取劑，用于提取血漿中非靶向代謝物，可具有較高的代謝物覆蓋率。筆者分別使用乙腈、甲醇–乙腈（1∶1）、甲醇–丙酮（1∶1）、甲醇–丙酮（1∶2）作為提取劑，對血漿質(zhì)控樣品中小分子代謝物檢測數(shù)量進行考察，結(jié)果列于表2。試驗表明，以甲醇–丙酮（1∶1）作為提取劑可以獲得最大的小分子代謝物檢測數(shù)量。

表2 不同提取劑提取血漿中小分子代謝物的數(shù)量

對凈化后的樣品進行濃縮復溶，有利于提高樣品中微量代謝物的濃度，但濃縮亦會增加樣品基質(zhì)的濃度，因此有必要考察復溶劑用量對代謝物檢測數(shù)量的影響。此外復溶后樣品的凈化有過膜和高速離心兩種方式，過膜凈化快速、高效，有利于滿足后續(xù)研究對檢測樣品高通量的需求，但需考察樣品過膜對代謝物檢測數(shù)量的影響。對以上兩個因素進行考察，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，樣本不經(jīng)濃縮復溶，只進行過膜凈化可取得最多的代謝物檢測數(shù)量。

圖1 不同提取及檢測條件下血漿中代謝物的檢測數(shù)量

2.2 色譜條件優(yōu)化

反相液相色譜（RPLC）是目前代謝組學研究中使用最為廣泛的分離手段，部分原因在于它與血漿、尿液等生物樣品有非常好的兼容性。從RPLC 系統(tǒng)的固定相方面考察，Acquity BEH 柱非常適合于血漿樣品中等極性和非極性代謝物的分離，而Acquity HSS T3 柱的鍵合硅膠對極性和離子型代謝物的保留有所增強，筆者著重考察這兩種色譜柱的保留及分離效能。結(jié)果顯示Acquity HSS T3 柱對血漿中代謝物的保留數(shù)量大于Acquity BEH 柱，結(jié)果見圖1。由圖1 可見，Acquity HSS T3 柱在選定的實驗條件下對血漿代謝物的保留數(shù)為9 973 個，明顯多于BEH柱保留的7 205 個。同時考察發(fā)現(xiàn)，向水相及有機相中同時添加體積分數(shù)為0.1%的甲酸能夠顯著提高待測物的離子化效率，提高信號響應(yīng)值，使實驗條件下代謝物的檢測數(shù)量從8 367 個提高到9 973 個。

對反相液相色譜流動相進行篩選，使用不同流動相獲得的色譜圖如圖2。圖2（a）為乙腈作為有機相的血漿代謝物總離子流圖，圖2（b）為甲醇作為有機相的血漿代謝物總離子流圖。由圖2（b）可見，甲醇洗脫脂質(zhì)污染物的效果比乙腈好，但本底信號強，噪音大；而乙腈的本底值低于甲醇，有利于血漿中痕量代謝物的檢測。以代謝物天冬氨酸(m／z134.107，7.41 min)提取信號為例，甲醇作為有機相時天冬氨酸信號完全被本底掩蓋［圖2（c）］，而乙腈作為有機相時響應(yīng)信號良好［圖2（d）］。

圖2 不同流動相的色譜圖

2.3 樣品穩(wěn)定性考察

以內(nèi)標物質(zhì)2-氯-苯丙氨酸（m／z119.6，2.06 min）作為考察對象，對血漿樣品的日內(nèi)穩(wěn)定性進行考察。取血漿質(zhì)控樣品，置于4℃自動進樣器中，分別放置0，4，8，12，24 h 后用本法測定，計算各時間點色譜峰強度與保留時間的相對標準偏差，以考察樣品的穩(wěn)定性，試驗結(jié)果列于表3。由表3 數(shù)據(jù)可知，2-氯-苯丙氨酸色譜峰強度與保留時間測定值的相對標準偏差均小于15%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

表3 血漿樣品的日內(nèi)穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.4 方法重復性考察

以內(nèi)標物質(zhì)2-氯-苯丙氨酸（m／z119.6，2.06 min）作為考察對象，對方法的重復性進行考察。方平行稱取5 份血漿質(zhì)控樣品，分別進行分析并計算色譜峰強度和保留時間的相對標準偏差，以考察分析方法的精密度，試驗結(jié)果列于表4。由表4 數(shù)據(jù)可知，色譜峰強度與保留時間的相對標準偏差均小于15%，表明分析方法重復性精密度良好。

表4 方法重復性試驗結(jié)果

2.5 血漿樣品測定

應(yīng)用本法對4 份健康志愿者血漿樣品進行測定，結(jié)果顯示，所有樣品在質(zhì)量范圍100～1 000 Da內(nèi)均檢測到近萬個代謝物。

3 結(jié)語

在人體生物樣本非靶向代謝組學研究過程中，樣品和數(shù)據(jù)采集是代謝組學研究的初始步驟，更是整個研究的起點，盡可能多地檢測出生物樣本中的小分子代謝物，提高代謝物覆蓋率是獲得生物代謝標志物的基礎(chǔ)和前提。筆者建立的人血漿樣品前處理及液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法能夠?qū)崿F(xiàn)對血漿代謝物的較高覆蓋率，保證數(shù)據(jù)采集的準確性、靈敏性和高通量，為后續(xù)研究提供可靠的技術(shù)基礎(chǔ)。