周 蘭，黃海濤，徐 彩，左茜茜，張蕓娜，黃文玲，祁 冰，卜曉玲

（1北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京100078，3河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050091）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）是生育障礙的常見病癥之一，臨床亦稱習(xí)慣性流產(chǎn)，主要是與相同性伴侶在妊娠20周內(nèi)連續(xù)有超過2次的自然流產(chǎn)的現(xiàn)象[1]。

RSA是生殖領(lǐng)域的一大難點，越來越受到臨床重視及關(guān)注。RSA的明確病因包括父母染色體異常（如平衡易位攜帶者等）、母親子宮結(jié)構(gòu)異常、內(nèi)分泌異常、自身免疫異常（如抗磷脂抗體綜合征）等，但仍有40%的人群無法明確病因[2]，并且直接影響臨床治療方法及效果。目前對于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的研究熱點聚焦于免疫排斥及免疫耐受。正常妊娠是一個類似于同種異體移植的復(fù)雜生理過程。胎兒攜帶的父源性白細(xì)胞組織相容性抗原（HLA）不被母體免疫系統(tǒng)排斥的關(guān)鍵，在于母胎間的免疫耐受關(guān)系。母-胎免疫耐受微環(huán)境失調(diào)是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的重要影響因素[3]。既往的研究認(rèn)為，Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡是維持生理性妊娠所必需的，其中Th1細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，與組織損傷相關(guān)，可抑制胚胎著床、滋養(yǎng)細(xì)胞生長和胚胎的發(fā)育，不利于妊娠的維持；Th2細(xì)胞介導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖、抗體產(chǎn)生和同種免疫耐受作用[4]。近年來，輔助性T細(xì)胞家族的新成員Th17細(xì)胞，與介導(dǎo)免疫耐受的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，兩者平衡的相關(guān)研究備受關(guān)注。Th17細(xì)胞可引起母胎界面劇烈的局部炎癥，導(dǎo)致母體容受性降低，繼而發(fā)生流產(chǎn)[5]。而介導(dǎo)免疫耐受的Treg細(xì)胞由于其存在免疫無能及免疫抑制的作用特點，可抑制母體對胎兒的免疫反應(yīng)，進(jìn)而維持妊娠[6]。有越來越多的證據(jù)表明，Treg和Th17細(xì)胞分別作為調(diào)節(jié)性和效應(yīng)性細(xì)胞，參與了妊娠的建立與維持[7-10]。

目前臨床對于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的常規(guī)西醫(yī)治療是補(bǔ)充孕激素。中醫(yī)方面，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病機(jī)主要責(zé)之脾腎兩虛，氣血不足。臨床諸家報道多以健脾益腎、益氣養(yǎng)血安胎為基本治療大法[11-12]。基于此，本研究采用自然流產(chǎn)模型小鼠，觀察中藥自擬固胎煎對流產(chǎn)小鼠模型胚胎丟失率及Th17/Treg細(xì)胞的影響，探討健脾益腎、益氣養(yǎng)血安胎中藥固胎煎對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的治療機(jī)制及作用機(jī)制。

1 實驗動物與試劑

1.1 動物 SPF級CBA/J雌鼠48只，BALB/C雄鼠4只，DBA/2雄鼠 20只，周齡 8～10周，體質(zhì)量（20±2）g。CBA/J雌鼠購于北京華阜康生物科技有限公司[許可證號：SCXK（京）2014-0004]；BALB/C 雄鼠、DBA/2雄鼠購于北京維通利華生物科技有限公司[許可證號：SCXK（京）2016-0006]。

1.2 藥物 自擬固胎煎組成：桑寄生10 g，菟絲子15 g，覆盆子 10 g，苧麻根 9 g，白術(shù) 10 g，茯苓 10 g，女貞子15 g，墨旱蓮10 g，蓮須6 g，中藥飲片購于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院。制備：用8倍水浸泡，過夜，先煮沸30 min，倒出藥液，再加入8倍水，煮沸20 min，最后再加5倍水，煮沸20 min，合并藥液并減壓濃縮，最后配制成自擬固胎煎煎劑（含生藥1.425 g/mL），置-20℃冰箱備用。地屈孕酮溶液：由地屈孕酮片[Abbott Biologicals B.V.（荷蘭）；批號：H20130110；規(guī)格：10 mg/片]3片溶于200 mL蒸餾水制成，稀釋至1.5×10-4mg/mL，置-20℃冰箱備用。

1.3 試劑及儀器 小鼠淋巴細(xì)胞分離液（產(chǎn)品編號為：DKW33-R100），購自達(dá)科為生物工程有限公司；Fox P3-APC（17-5773-82）和 Foxp3 Staining Buffer Set（00-5523-00），購自 eBioscience公司；CD3e-PerCP-Cy5.5（561163），CD4-FITC（553047），CD25-PE（553866），F(xiàn)ox P3-APC（17-5773-82），RORγt-BV421（562894），F(xiàn)cR 阻斷劑（CD16/32）（553142），含1% FBS的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）和溶血素（349202），購自BD PMG公司；流式細(xì)胞儀（FacsCalibur，美國BD公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 將CBA/J雌鼠與BALB/c雄鼠2∶1合籠，建立正常妊娠模型（CBA/J×BALB/c組），CBA/J雌鼠與DBA/2雄鼠2∶1合籠，建立自然流產(chǎn)模型（CBA/J×DBA/2組）。每天 20∶00開始合籠，早上8∶00檢查陰栓，肉眼觀察陰道口有無乳白色、固態(tài)膠狀物，發(fā)現(xiàn)明顯陰栓者為陽性。檢出陰栓的小鼠計為妊娠第0天。正常妊娠組予0.9%生理鹽水灌胃；自然流產(chǎn)模型組孕鼠隨機(jī)分為自然流產(chǎn)組、地屈孕酮組、中藥低劑量組（低劑量組）、中藥中劑量組（中劑量組）、中藥高劑量組（高劑量組），每組8只。自然流產(chǎn)組予0.9%生理鹽水灌胃，地屈孕酮組予地屈孕酮溶液灌胃，中藥低、中、高劑量組分別給予7.125、14.25、28.5 g/kg自擬固胎煎湯劑灌胃，每組灌胃量均稀釋至0.4mL，連續(xù)灌胃2周，每日1次。

2.2 胚胎吸收率的計算 孕14 d斷頸處理小鼠，迅速解剖，用鑷子撕開子宮，記錄被吸收的胚胎數(shù)和存活胚胎數(shù)。胚胎丟失的判斷標(biāo)準(zhǔn)：丟失之胚胎體積明顯縮小，胎兒胎盤單位有明顯出血或壞死。胚胎丟失率（ELR）的計算方法按下列公式進(jìn)行：ELR=丟失胚胎數(shù)/（丟失胚胎數(shù)+存活胚胎數(shù)）×100%。

2.3 流式細(xì)胞檢測脾臟Th17、Treg細(xì)胞含量 流式細(xì)胞儀檢測孕鼠脾臟Th17/CD4+、Treg/CD4+細(xì)胞。研磨脾臟，并用淋巴分離液分離脾臟細(xì)胞，在試管中加入106個脾細(xì)胞，加入FcR阻斷劑1 μg，混勻，室溫孵育 15 min；加入 CD3e、CD4、CD25 各 1 μg，混勻，室溫避光孵育30 min；加2 mL預(yù)冷的含1%FBS的 PBS，500×g，5 min；棄上清，混勻；加入 1 mL 新鮮制備的eBioscience Fixation/Permeabilization應(yīng)用液（1×）；混勻，室溫避光孵育 60 min；加入 2 mL Permeabilization Buffer（1×），500×g，5 min；棄上清，混勻，再重復(fù)此步驟1次；加入100 μL Permeabilization Buffer（1×）、1 μg Foxp3-APC 和 1 μg RORγt-BV421混勻，4℃避光30 min；加入2 mL Permeabi lization Buffer（1×）500×g，5 min；棄上清液，混勻；加2 mL 含 1%FBS 的 PBS，500×g，5 min；棄上清液，混勻；加入 0.2 mL PBS（1%FBS），1 h 內(nèi)上機(jī)獲取分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)性及方差齊性組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 自擬固胎煎對自然流產(chǎn)模型孕鼠胚胎丟失率的影響 與正常妊娠組相比，自然流產(chǎn)組、地屈孕酮組、中藥高、中、低劑量組流產(chǎn)率均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與自然流產(chǎn)組相比，中劑量組、高劑量組和地屈孕酮組流產(chǎn)率均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），低劑量組流產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與低劑量組相比，中劑量組、高劑量組和地屈孕酮組流產(chǎn)率均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表 1。

3.2 自擬固胎煎對自然流產(chǎn)模型孕鼠Th17/CD4+、Treg/CD4+細(xì)胞的影響 與正常妊娠組相比，自然流產(chǎn)組、地屈孕酮組、高劑量組、中劑量組和低劑量組Th17/CD4+細(xì)胞數(shù)及Th17/Treg細(xì)胞百分率比值均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與自然流產(chǎn)組相比，中劑量組、高劑量組和地屈孕酮組Th17/CD4+細(xì)胞數(shù)及Th17/Treg細(xì)胞百分率比值均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），低劑量組Th17/CD4+細(xì)胞數(shù)及Th17/Treg細(xì)胞百分率比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與低劑量組相比，中劑量組、高劑量組和地屈孕酮組Th17/CD4+細(xì)胞數(shù)及Th17/Treg細(xì)胞百分率比值均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且中藥中劑量組、高劑量組、地屈孕酮組3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組孕鼠胚胎丟失率比較Tab.1 Comparison of the embryo loss rate of pregnant mice in each group

與正常妊娠組相比，自然流產(chǎn)組、地屈孕酮組、高劑量組、中劑量組和低劑量組Treg/CD4+細(xì)胞數(shù)均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與自然流產(chǎn)組相比，中劑量組、高劑量組和地屈孕酮組Treg/CD4+細(xì)胞數(shù)均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），低劑量組Treg/CD4+細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與低劑量組相比，中劑量組、高劑量組和地屈孕酮組Treg/CD4+細(xì)胞數(shù)均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且中藥中劑量組、高劑量組、地屈孕酮組3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、圖1和圖2。

4 討論

Th17細(xì)胞是一種新型CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞亞群，近年來已成為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)RSA機(jī)制研究的一大熱點。研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠期，母胎界面同種異體的胚胎抗原刺激產(chǎn)生的炎性介質(zhì)，系統(tǒng)性炎癥以及增加的炎性細(xì)胞因子均可能誘發(fā)Th17細(xì)胞的分化。蛻膜中的NK細(xì)胞能夠通過IFN-y通路抑制Th17調(diào)節(jié)的局部炎性反應(yīng)。RSA的女性患者中，NK細(xì)胞介導(dǎo)的調(diào)節(jié)功能喪失，Th17細(xì)胞比例明顯增加，導(dǎo)致Th17細(xì)胞引起的局部炎癥顯著加劇，并最終導(dǎo)致母體容受性的喪失[4]。

圖1 各組孕鼠脾臟中Th17/CD4+的細(xì)胞流式圖Fig.1 Cell flow diagram of Th17/CD4+in spleen of pregnant mice in each group

圖2 各組孕鼠脾臟中Treg/CD4+的細(xì)胞流式圖Fig.2 Cell flow diagram of Treg/CD4+in spleen of pregnant mice in each group

表2 各組孕鼠脾臟中Th17/CD4+、Treg/CD4+相對表達(dá)水平（±s）Tab.2 Relative expression levels of Th17/CD4+，Treg/CD4+in spleen of pregnant mice in each group（±s）

表2 各組孕鼠脾臟中Th17/CD4+、Treg/CD4+相對表達(dá)水平（±s）Tab.2 Relative expression levels of Th17/CD4+，Treg/CD4+in spleen of pregnant mice in each group（±s）

注：與正常妊娠組比較，*P＜0.05；與自然流產(chǎn)組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05。

組別低劑量組中劑量組高劑量組地屈孕酮組自然流產(chǎn)組正常妊娠組動物數(shù)8 8 8 8 8 8 T h 1 7/C D 4+（%）T r e g/C D 4+（%）T h 1 7/T r e g 0.7 2±0.1 5* 8.9 4±0.8 8* 8.0 0±2.2 4*0.4 4±0.1 1*#△ 9.7 2±1.4 7*#△ 4.4 0±1.3 4*#△0.6 0±0.1 6*#△ 9.4 2±1.1 5*#△ 6.6 0±2.3 0*#△0.5 0±0.1 4*#△ 1 0.0 2±2.5 5*#△ 5.2 0±1.9 2*#△1.2 0±0.2 1* 6.7 2±1.1 4* 1 8.0 0±2.3 5*0.2 4±0.0 5 1 3.8 6±3.0 1 1.8 0±0.4 5

Treg主要分為胸腺發(fā)育的天然調(diào)節(jié)T細(xì)胞（nTreg）和來源于外周的誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞（iTreg）。在妊娠小鼠和人類，當(dāng)母體免疫細(xì)胞第1次接觸與侵入滋養(yǎng)層有關(guān)的胎兒抗原時，Treg的擴(kuò)增發(fā)揮了關(guān)鍵的保護(hù)作用。Treg細(xì)胞可抑制母體對同種異體移植物胎兒的免疫反應(yīng)，并在此過程中發(fā)揮重要作用，利用細(xì)胞的調(diào)節(jié)免疫，加速耐受的形成和維持妊娠[5，13]。

Th17和Treg細(xì)胞在母-胎免疫耐受方面具有關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，Th17細(xì)胞分泌促炎因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)；Treg細(xì)胞分泌抗炎因子，抑制免疫反應(yīng)，兩者雖然在功能上有拮抗作用，但在起源上具有同源性[14]，它們在不同的細(xì)胞因子作用下由CD4+T細(xì)胞分化而來，在一定條件下Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞可相互轉(zhuǎn)化[15-16]。一旦Th17/Treg平衡被打破，無論是Th17細(xì)胞增多還是Treg細(xì)胞減少，都有可能導(dǎo)致胚胎排斥的發(fā)生[17]。

孕激素補(bǔ)充是目前臨床治療RSA的常規(guī)治療手段。研究認(rèn)為，在一定孕激素水平下，孕激素受體陽性的淋巴細(xì)胞和蛻膜CD56+細(xì)胞可分泌孕激素誘導(dǎo)封閉因子（PIBF），誘導(dǎo)Th1/Th2平衡向Th2型轉(zhuǎn)化，從而使Th17/Treg下調(diào)，增強(qiáng)母體免疫耐受，從而有利于妊娠[18-19]。本研究使用地屈孕酮作為陽性對照藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地屈孕酮組孕鼠的胚胎丟失率顯著低于自然流產(chǎn)組，且Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞及其比例與自然流產(chǎn)組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果與文獻(xiàn)相符。

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)屬于中醫(yī)“滑胎”的范疇，臨床公認(rèn)的病機(jī)為脾腎兩虛，氣血不足，自擬固胎煎以補(bǔ)腎健脾，益氣養(yǎng)血安胎為法，是在經(jīng)方壽胎丸基礎(chǔ)上化裁而來，方中菟絲子滋補(bǔ)肝腎、固精安胎為君藥，桑寄生、覆盆子補(bǔ)肝腎，固精益血，白術(shù)、茯苓健脾益氣，且茯苓能寧心安神，以上諸藥合用共為臣藥，亦補(bǔ)先天生化之本以補(bǔ)腎安胎，又健后天氣血化生之源以安胎，女貞子、墨旱蓮補(bǔ)腎滋陰，清熱涼血，苧麻根清熱安胎，以防補(bǔ)益藥物的溫補(bǔ)滋膩，蓮須固腎澀精，四者合為佐藥。諸藥合用，共奏補(bǔ)腎健脾，清熱安胎之效?？v觀全方配伍精當(dāng)，既補(bǔ)先天后天的脾腎以滋兩臟之精氣，又益氣補(bǔ)血以載胎養(yǎng)胎，使養(yǎng)胎有源，固胎有力，配以清熱涼血藥物，合增安胎之功。本研究發(fā)現(xiàn)，自擬固胎煎中劑量組、高劑量組均可下調(diào)脾臟中Th17細(xì)胞的比例，上調(diào)Treg細(xì)胞比例，促使Th17/Treg平衡向Treg方向移動，降低自然流產(chǎn)小鼠的胚胎丟失率，效果與地屈孕酮相當(dāng)，可于臨床推廣。