朱嘉瑩， 李 婷， 丁重陽， 東為富

（江南大學化學與材料工程學院，合成與生物膠體教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

當前，微生物引起的許多問題威脅著人類健康和生存環(huán)境。細菌對材料表面的黏附使薄膜[1]、醫(yī)療設備[2]、食品和飲料包裝[3]等的應用存在極大的被污染隱患。目前常見的制備抗菌材料的主要方法是，在材料表面負載抗菌劑，常用抗菌劑有:天然抗生素[4]、金屬和氧化物納米顆粒[5,6]、季銨化合物[7]和聚吡啶等[8]。

同有機抗菌劑相比，無機抗菌劑特別是金屬及其氧化物具有抗菌性強、耐高溫、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。傳統(tǒng)的金和銀被認為是良好的抗菌材料[9]，然而，高成本限制了它們的應用。因此，廉價的金屬無機抗菌劑的研發(fā)備受關注。銅作為一種廉價抗菌劑已廣泛用于醫(yī)療器械[10]、木材防腐[11]、紡織品[12]等領域。目前銅的抗菌機理尚存爭議，主流觀點認為銅納米粒子（Cu NPs）吸附在細菌細胞壁表面破壞細胞壁結構，還原性的Cu NPs與細菌相互作用后在細胞壁的表面釋放活性氧（ROS），逐漸破壞細胞結構，且銅釋放出的銅離子也可有效抑制周圍細菌生長[13]。盡管Cu NPs 顯示出優(yōu)異的抗菌性能，但是過量的銅離子亦將對人類健康構成威脅[14]。當游離的銅離子進入人體后，會危害器官，特別是肝臟和膽囊；另外，它對許多水生生物也都有很大的負面影響。因此，為了減輕銅離子的危害，選擇合適的載體非常重要。此外，Cu NPs 易于聚集的問題使其實際應用面臨著巨大挑戰(zhàn)。目前防止Cu NPs 聚集的有效方法是將其沉積在固體多孔材料上，例如SiO2、沸石和碳材料等[15,16]。其中許多多孔材料表面可用多巴胺預先修飾以達到對金屬離子吸附的目的[17,18]。

聚多巴胺（PDA）納米粒子由多巴胺自聚而成，由于PDA 中存在許多功能基團，包括鄰醌、鄰苯二酚、氨基、亞氨基等[19]，它可與多種多價金屬離子結合，如Fe3+、Ag+、Cu2+等。金屬離子Cu2+經過氧化還原后可與PDA 形成金屬粒子負載的PDA 復合微球，其優(yōu)點主要為:（1）PDA 微球易于合成且產率高；（2）PDA 豐富的兒茶酚和氨基可以通過緊密結合的方式絡合Cu NPs；（3）PDA 球表面上Cu NPs 的覆蓋率可控。

本文利用多巴胺結合金屬離子的能力將銅離子固定在PDA 表面，用水合肼原位還原銅離子，形成樹莓結構的PDA-Cu NPs，并進一步研究了該復合微球的抗菌性能。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

鹽酸多巴胺:化學純，上海阿拉丁試劑有限公司；三水合硝酸銅（Cu（NO3）2·3H2O，化學純）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，優(yōu)級純）、水合肼（H6N2O，w=85%，化學純）:國藥集團化學試劑有限公司；實驗室用水為去離子水。

1.2 測試與表征

1.2.1 納米粒子的基本結構表征 場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）:日本日立株式會社S-4800 型，將制備的納米粒子置于真空烘箱充分干燥，并固定于電鏡臺噴金處理進行測試；X 射線衍射（XRD）儀:德國布魯克AXS有限公司 Bruker D8 型，掃描范圍10°～90°，掃描速率3（°）/min；Zeta 電位及納米粒度分析儀:美國布魯克海文公司 ZetaPALS 型，測試溫度為25 ℃；接觸角測量儀:北京東方德菲儀器有限公司 OCA40 型，將樣品分散在無水乙醇中并將分散液平鋪于載玻片上，干燥后測量。

1.2.2 細菌培養(yǎng) 制備細菌懸浮液的過程如下:取50 μL 大腸桿菌（E.coil，ATCC#25922）或表皮葡萄球菌（S.epidermidis，ATCC#12228）的菌原液注入15 mL 的無菌Luria-Bertani（LB）肉湯中，放入37 ℃的搖床中振蕩培養(yǎng)5 h 后，用無菌超純水稀釋至105CFU/mL 備用。

1.2.3 PDA-Cu NPs 的抗菌性能測試 采用搖瓶法測試納米粒子的抗菌性能[20]。將1 mL 納米粒子的水分散液（5 mg/mL）加入至含有9 mL 菌懸液（105CFU/mL）的燒瓶中。將燒瓶保持在37 ℃的振動臺上20 min 后，取出100 μL 混合懸浮液并稀釋至合適濃度。將每種稀釋液（100 μL）接種到LB 固體培養(yǎng)基上，然后翻轉平板在37 ℃恒溫箱中孵育24 h 后統(tǒng)計細菌菌落數(shù)。

采用紙片擴散法測試納米粒子的抗菌性能。將無菌濾紙裁成直徑為6 mm 的圓形，將100 μL 的原菌液涂布在瓊脂板上，隨后放入剪裁好的紙片，將相同濃度不同銅含量的PDA-Cu NPs 分散液滴在紙片上，在37 ℃下孵育24 h 后觀察抑菌圈尺寸。

采用肉湯基稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC）與最小殺菌濃度（MBC）。將PDA-Cu NPs 稀釋至250 mg/mL 滅菌備用。取若干試管標記為1～7。1 號試管中加入5 mL 培養(yǎng)基和4 mL 去離子水，其余試管均加入2.5 mL 培養(yǎng)基和2.5 mL 去離子水，滅菌。取1 mL PDA-Cu NPs 稀釋液至1 號試管中，振蕩分散。然后從1 號試管中取5 mL溶液至2 號試管中，重復上述步驟直至7 號試管，最后從7 號試管中取5 mL 棄去。每支試管中接入0.5 mL、105CFU/mL 菌液。對照組為2.5 mL 培養(yǎng)基和2.5 mL 去離子水，一支加入0.5 mL 去離子水（空白對照），另一支加入0.5 mL 菌液（陽性對照），37 ℃下培養(yǎng)12 h，試管中溶液開始澄清的濃度即為MIC。

從出現(xiàn)澄清溶液的試管中取出100 μL 稀釋液接種到LB 固體培養(yǎng)基上，然后翻轉平板在37 ℃恒溫箱中孵育24 h 后統(tǒng)計細菌菌落數(shù)。當培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)少于5 個時，最低的質量濃度即為MBC。

1.3 實驗步驟

1.3.1 PDA 的制備 根據(jù)文獻[21]制備PDA。將0.18 g 鹽酸多巴胺溶于90 mL 去離子水中，于50 ℃下充分攪拌，再加入0.38 mL、1 mol/L 的氫氧化鈉溶液，反應5 h 后離心數(shù)次，置于60 ℃烘箱中干燥即得到產物PDA。

1.3.2 PDA-Cu NPs 的制備 取已烘干的PDA 顆粒50 mg，配成1 mg/mL 的水溶液，用細胞粉碎機使顆粒均勻分散在溶液中，隨后加入150 mg 的PVP，300 mg 的Cu（NO3）2·3H2O，在室溫下攪拌4 h 后轉移到60 ℃的油浴鍋中，加入2.1 g 的水合肼，反應1 h 后，離心數(shù)次得到PDA-Cu NPs，置于60 ℃烘箱中干燥備用。文中按m（PDA）/m（Cu（NO3）2）=x/y，將產物標記為PDA-Cu NPs（x/y），其制備示意圖見圖1。

圖1 PDA-Cu NPs 的合成示意圖Fig.1 Synthesis of PDA-Cu NPs

2 結果與討論

2.1 納米粒子的微觀形貌及粒徑

PDA 和PDA-Cu NPs 的微觀形貌如圖2 所示。圖2（a）中，純PDA 表面較為光滑，粒徑為500 nm 左右。據(jù)文獻[19]報道，PDA 可以鰲合金屬離子并將其原位還原，但從圖2（b）可以看出，在不添加還原劑水合肼的情況下，PDA 與Cu（NO3）2溶液攪拌24 h 后，只有少量的Cu NPs 被還原，說明其自身還原性不足以在表面大量還原Cu NPs。從圖2（c）中可以看出，選用水合肼作為還原劑制備的PDA-Cu NPs（1/4），大量Cu NPs 被還原，其平均直徑約為50 nm，并負載于PDA 表面。

圖2 （a） PDA，（b） 僅由PDA 還原的PDA-Cu NPs（1/4）和（c）由水合肼還原的PDA-Cu NPs（1/4） 的納米粒子SEM 照片F(xiàn)ig.2 SEM images of （a） PDA, （b） PDA-Cu NPs（1/4） reduced by PDA only and （c） PDA-Cu NPs（1/4） reduced by H6N2O

Cu（NO3）2含量對Cu NPs 在PDA 上分散均勻性的影響如圖3 所示，從圖3（a，b）中可以看出，當m（PDA）∶m（Cu（NO3）2）=1∶2，1∶4 時，負載在PDA 表面的Cu NPs 較少，隨著Cu（NO3）2用量的增加，PDA 表面的Cu NPs 增加，且分布較為分散（圖3（c））；繼續(xù)增加Cu（NO3）2的用量，如圖3（d）所示，部分Cu NPs 在PDA 表面出現(xiàn)團聚現(xiàn)象，會影響其Cu2+的釋放。

圖3 PDA-Cu NPs 的SEM 照片F(xiàn)ig.3 SEM images of PDA-Cu NPs

還原溫度對PDA 表面Cu NPs 粒徑的影響如圖4 所示。當還原溫度較低時（20，40 ℃），PDA 表面Cu NPs的粒徑不均一（圖4（a，b））；當還原溫度進一步升高時（60 ℃），PDA 表面的Cu NPs 粒徑較均一，約為50 nm（圖4（c，d））。進一步升高還原溫度（80 ℃），Cu NPs 粒徑沒有明顯變化，故選擇60 ℃作為制備PDA-Cu NPs的最佳還原溫度。

圖5 顯示了引入Cu NPs 前后PDA 平均粒徑的變化。PDA 的平均粒徑約為600 nm，PDA-Cu NPs 的平均粒徑為650 nm 左右，顯示了負載Cu NPs 后PDA 微球平均粒徑的增大。兩者粒徑分布都較寬，同SEM 結果對照，納米粒度儀所測數(shù)值偏大，這是由于部分粒徑的PDA 發(fā)生了團聚，這也是粒徑分布較寬的原因，但從圖5（b，b’）和圖5（c，c’）來看， PDA 以及PDA-Cu NPs 分散液在靜置24 h 后未出現(xiàn)明顯的分層情況，顯示出納米顆粒良好的分散穩(wěn)定性。

2.2 納米粒子的Zeta 電位和XRD 分析

圖4 不同還原溫度下PDA-Cu NPs（1/4）的SEM 照片F(xiàn)ig.4 SEM images of PDA-Cu NPs（1/4） reduced at different temperatures

圖5 （a） PDA 與PDA-Cu NPs 的粒徑分布；（b） PDA 分散后和 （b’）靜置24 h 后的照片；（c） PDA-Cu NPs 分散后和（c’）靜置24 h 后的照片F(xiàn)ig.5 （a） Particle size distribution of PDA and PDA-Cu NPs; Photos of （b） PDA suspension and （b’） PDA suspension after standing 24 h;Photos of （c） PDA-Cu NPs suspension and （c’） PDA-Cu NPs suspension after standing 24 h

表1 為PDA 與PDA-Cu NPs 在水中的Zeta 電位數(shù)據(jù)。純PDA 納米粒子的負電位（-29.4 mV）是由PDA納米粒子表面帶負電的羥基引起的。當帶負電位的羥基與金屬離子絡合還原后，帶正電的Cu NPs 與帶負電的羥基反應，使PDA-Cu NPs 納米粒子的表面電位增加，其電位向正方向移動。從表1 中可以看出，隨著Cu（NO3）2含量的增加，PDA-Cu NPs 粒子的表面電位逐漸提高，表明PDA 上Cu NPs 的含量亦隨之增加，與其SEM 分析結果相互印證。

圖6 為純PDA 與PDA-Cu NPs 的XRD 衍射圖譜。從圖6 中可以看出，PDA 的XRD 圖譜表現(xiàn)出典型的非晶衍射特征，說明其為無定形結構。PDACu NPs 在43°、50°和74°的特征峰分別歸屬于純銅的（111）、（200）和（220）晶面（JCPDS 卡號04-0836），而純PDA 不具有此類晶面，也說明Cu NPs 確實負載于PDA 表面。

2.3 接觸角測試

圖7 展示了PDA 以及PDA-Cu NPs 構成表面的潤濕狀態(tài)。從圖中可以看出，純PDA 構成的表面親水，接觸角為28.9°，這是由于其表面含有大量親水性基團。雖然純PDA 與Cu NPs 自身都表現(xiàn)出親水性，但當Cu NPs 負載于PDA 球后，形成的樹莓狀納米粒子粗糙度提升，PDA-Cu NPs（1/6）的接觸角可達92.9°，表現(xiàn)為疏水性，PDA-Cu NPs（1/8）的表面接觸角可提高至102.2°。

表1 PDA 和PDA-Cu NPs 的Zeta 電位Table 1 Zeta potential of PDA and PDA-Cu NPs

圖7 PDA 和PDA-Cu NPs 的水接觸角Fig.7 Water contact angles of PDA and PDA-Cu NPs

2.4 納米粒子的抗菌測試

圖8 顯示了PDA-Cu NPs 對大腸桿菌和表皮葡萄球菌的抗菌性能。從圖8（a）中可以看出，PDA-Cu NPs（1/2）的抗菌率只達到約45%，抗菌性能較差；PDA-Cu NPs（1/4）的抗菌率可達到85%以上，PDA-Cu NPs（1/8）可實現(xiàn)對細菌的100%殺死，顯示出優(yōu)異的抗菌性能。

圖8 （a） 銅含量對PDA-Cu NPs 抗菌性能的影響;（b） PDA-Cu NPs 對大腸桿菌的抑菌圈照片F(xiàn)ig.8 （a） Effect of copper source content on antibacterial properties of PDA-Cu NPs; （b） Inhibition zone picture of PDA-Cu NPs to E.coli

從圖8（a）還可以看出，所制備的納米粒子對表皮葡萄球菌的抗菌性能要明顯優(yōu)于對大腸桿菌的，這可能是因為與革蘭氏陽性細菌（表皮葡萄球菌）相比，革蘭氏陰性細菌（大腸桿菌）除了肽聚糖外還具有外膜結構，該外膜可以保護細菌免受攻擊。

圖8（b）顯示出不同粒子對大腸桿菌的抑菌圈大小，從圖中可以看出，PDA-Cu NPs（1/2）和PDA-Cu NPs（1/4）抑菌圈不明顯，PDA-Cu NPs（1/6）則出現(xiàn)明顯的抑菌圈，顯示出較高的抗菌性能，且其抑菌圈直徑大于PDACu NPs（1/8）的，結合SEM 分析，可能因為銅含量較高時，引起Cu NPs 的團聚，從而影響其抗菌性能。

PDA-Cu NPs（1/6）對表皮葡萄球菌和大腸桿菌的MIC 和MBC 測試結果列于表2。從表2 可以看出，PDA-Cu NPs（1/6）對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均具有很高的抗菌活性。PDA-Cu NPs（1/6）對大腸桿菌的MIC 和MBC 值分別為48.7 μg/mL和195.0 μg/mL，對表皮葡萄球菌的MIC 和MBC 值分別為39.0 μg/mL 和97.5 μg/mL。

3 結 論

（1）通過簡單調節(jié)反應物投料比以及還原溫度可以實現(xiàn)Cu NPs 在PDA 上的均勻分散，成功制備一種簡單高效且價格低廉的抗菌劑。

（2）得益于Cu NPs 對表皮葡萄球菌和大腸桿菌優(yōu)異的抗菌性能以及PDA 的生物相容性，此樹莓狀PDA-Cu NPs 納米粒子在生物醫(yī)療等方面應用前景可期。

表2 PDA-Cu NPs（1/6）對不同細菌的抗菌效果Table 2 Antibacterial efficency of the synthesized PDA-Cu NPs（1/6）against different bacteria