常鈴雪， 何宏燕， 金莉莉， 劉昌勝

（華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，教育部醫(yī)用生物材料工程研究中心，上海 200237）

隨著組織工程與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，模仿細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)、制備仿生微結(jié)構(gòu)引起了科研人員的廣泛關(guān)注[1-4]。許多學(xué)者致力于研究植入材料的表面特性與細(xì)胞的相互作用，通過(guò)圖案化表面的可控制備，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的形貌、增殖、遷移、分化和基因表達(dá)的調(diào)控[5]。在骨修復(fù)中植入材料表面的微納結(jié)構(gòu)[6]特性（表面紋理、幾何形狀、空間位置和高度）的不同是影響成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)鍵因素之一，可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞向特定譜系進(jìn)行分化，指導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化和作為支撐結(jié)構(gòu)維持新骨的長(zhǎng)入[2,7-9]。Chang 等[10]研究發(fā)現(xiàn)骨間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的成骨分化能力在微孔表面上有所提高，微孔表面增強(qiáng)了細(xì)胞的黏著斑和肌動(dòng)蛋白的結(jié)合能力。Wang 等[11]證實(shí)在深溝槽基底上培養(yǎng)的BMSCs 的成骨分化能力明顯高于淺表面上的成骨分化能力。Dalby等[12]認(rèn)為納米結(jié)構(gòu)（直徑為120 nm）可以誘導(dǎo)人骨間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）在體外產(chǎn)生骨礦物質(zhì)和成骨分化。趙等[13]發(fā)現(xiàn)微孔和納米管相結(jié)合的分級(jí)微/拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)BMSCs 成骨分化能力有著顯著的影響。由此可見(jiàn)，微結(jié)構(gòu)采用的基底材料和結(jié)構(gòu)特性在調(diào)控 BMSCs 的生物學(xué)響應(yīng)中尤為重要。然而，這些微結(jié)構(gòu)的基底材料（例如聚二甲基硅氧烷[14]）通常生物活性不足。除了微結(jié)構(gòu)的特性之外，基底材料本身的理化特性對(duì)干細(xì)胞的影響也不容忽視。為了更好地調(diào)節(jié)干細(xì)胞的生物學(xué)行為和滿(mǎn)足骨組織修復(fù)的需要，有必要對(duì)制備生物活性好、結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)的微陣列結(jié)構(gòu)用于 BMSCs 的生物學(xué)行為進(jìn)行研究。

透明質(zhì)酸（HA）作為細(xì)胞外基質(zhì)的基本成分之一，具有良好的親水性和生物活性，在維持細(xì)胞外微環(huán)境、軟骨修復(fù)、傷口愈合等方面有著廣泛的應(yīng)用[15,16]，尤其是它可以作為藥物的載體以提高藥物的生物利用度。為了得到具有一定機(jī)械強(qiáng)度和生物相容性的 HA，本文用己二酸二酰肼（ADH）和N′-（乙基亞胺基亞甲基）-N, N-二甲基-1,3-丙二胺（EDCI）與 HA 交聯(lián)成膜。通過(guò)調(diào)節(jié)ADH 和EDCI 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（8.3%～16.7%），研究不同配比對(duì)薄膜的表觀(guān)結(jié)構(gòu)、膨脹系數(shù)、降解行為以及材料相容性的影響。對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行配比優(yōu)化后，選取合適的配比和聚二甲基硅氧烷（PDMS）軟光刻技術(shù)進(jìn)行微陣列結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)制備和特性評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

HA:純度97%，麥克林公司；己二酸二酰肼:純度＞99.0%，北京伊諾凱科技公司；EDCI:純度97%，上海泰坦科技公司；PDMS:SKYLARD184，道康寧公司；胎牛血清（FBS）、鷹最小基本培養(yǎng)基（MEM）、無(wú)鈣鎂改良MEM 培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶、噻唑藍(lán)（MTT）試劑:美國(guó)Gibco 公司；大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMSCs）:上海斯萊克公司。

1.2 HA 水凝膠的制備

將HA 粉末配成w=0.5% 的HA 水溶液，于4 ℃保存，溶脹1 d 后，將不同量的ADH 緩慢加入HA 溶液，之后加入EDCI 快速攪拌，反應(yīng)中用0.1 mol/L 的鹽酸維持pH≈4.75；反應(yīng)后調(diào)節(jié)體系pH=7.0，將反應(yīng)產(chǎn)物在0.1 mol/L 的NaCl 溶液中透析1 d，接著用超純水透析2 d。提純后液體直接倒入培養(yǎng)皿中，放入37 ℃恒溫箱內(nèi)干燥成膜；將HA 干膜浸泡于PBS 緩沖液中2 h，溶脹平衡后放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)中控制HA、ADH 與EDCI 的質(zhì)量比（mHA∶mADH∶mEDCI）分別為10∶1∶1、8∶1∶1、6∶1∶1 和4∶1∶1，相應(yīng)的凝膠樣品分別標(biāo)記為S1、S2、S3、S4。

1.3 HA 薄膜微陣列結(jié)構(gòu)的制備工藝

HA 薄膜 微陣列結(jié)構(gòu)的制備工藝如圖1 所示。首先采用軟光刻技術(shù)制備表面具有微米點(diǎn)陣列的硅片母板，用75%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液超聲清洗干燥后，使用商用SKYLARD184 進(jìn)行軟刻膠工藝對(duì)其進(jìn)行復(fù)制，得到與母板互補(bǔ)的微陣列結(jié)構(gòu)；然后將帶有微陣列結(jié)構(gòu)的PDMS 表面進(jìn)行等離子親水處理，使得HA 溶液能夠充分潤(rùn)濕PDMS 表面的微陣列結(jié)構(gòu)，最后通過(guò)溶劑揮發(fā)成膜法得到帶有微陣列結(jié)構(gòu)的HA 薄膜。

圖1 HA 薄膜微陣列結(jié)構(gòu)的制備工藝Fig.1 Preparation process of HA films with well-defined micropatterned surfaces

1.4 HA 薄膜的理化特性表征

傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）:HA 薄膜在-20 ℃冷凍過(guò)夜后進(jìn)行凍干處理，得到海綿結(jié)構(gòu)的HA 材料，取適量HA 與KBr 充分混合研磨后采取壓片制樣，掃描波長(zhǎng)4 000～500 cm-1；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立公司，S-4800 型）:HA 薄膜凍干處理后固定于樣品臺(tái)表面，噴金處理后，裁剪成4 mm×4 mm 方塊，用導(dǎo)電膠固定于SEM 樣品臺(tái)表面，設(shè)定時(shí)間為60 s 進(jìn)行噴金，置于樣品倉(cāng)，設(shè)置加速電壓為20 kV；恒溫震蕩箱（常州澳華儀器有限公司，SHA-B 型）及電子天平（上海良平儀器儀表有限公司，F(xiàn)A2104 型）:將HA 薄膜真空干燥稱(chēng)重（m0），以1∶10 的質(zhì)量比將HA 薄膜浸泡于PBS 緩沖液中，置于37 ℃溫和震蕩（80 r/min）3、7、10、14 d 后，將HA 薄膜真空干燥24 h 后稱(chēng)重（mi），通過(guò)計(jì)算得到剩余量（R），R 可用來(lái)評(píng)價(jià)凝膠薄膜的降解行為。

倒置生物顯微鏡（上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器公司，XSP-17C 型）:選用直徑10 μm、間距為15 μm 的模板制備了4種配方的HA 薄膜，采用倒置生物顯微鏡對(duì)HA 凝膠微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀(guān)察，并用納米測(cè)量技術(shù)對(duì)表面微結(jié)構(gòu)尺寸進(jìn)行測(cè)量。

1.5 細(xì)胞生物學(xué)性能研究

rBMSCs 細(xì)胞提取培養(yǎng)工藝如下:選用4 周齡、無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)80～100 g 的雄性SD 大鼠（上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），提取股骨和脛骨細(xì)胞。將rBMSCs 添加到FBS（φ=10%）、青霉素/鏈霉素雙抗（φ=1%）的α-MEM 培養(yǎng)基中，接種于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% （體積分?jǐn)?shù)）CO2、濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

對(duì)不同交聯(lián)度的HA 凝膠進(jìn)行生物相容性MTT 檢測(cè)，每組設(shè)置3 個(gè)平行樣。具體操作步驟如下:選用rBMSC 為細(xì)胞模型，以每孔2×103個(gè)的接種密度接種于96 孔板中37 ℃培養(yǎng)24 h 后，加入等量的凝膠樣品（S1～S4）于孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；在1、3、7 d 后，避光條件下每孔加入30 μL MTT 工作液（5 mg/mL），放入37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h；小心吸去孔板中上層溶液，每孔加入100 μL 二甲亞砜（DMSO），37 ℃恒溫震蕩溶解15 min；使用MK3 酶標(biāo)儀（Thermo Fisher）在波長(zhǎng)492 nm 下測(cè)量其透光率（OD）值。MTT 法也用于評(píng)級(jí)不同微陣列結(jié)構(gòu)表面對(duì)rBMSCs 體外增殖的影響，將HA 薄膜平鋪于48 孔板中，每孔加入1×104個(gè)細(xì)胞，30 min 后每孔加入1 mL 培養(yǎng)基。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、3、7 d 后，進(jìn)行MTT 測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 HA 凝膠的FT-IR 分析

圖2 示出了配比不同的HA 凝膠和未交聯(lián)HA的紅外光譜。如圖所示，相比于未交聯(lián)的HA，交聯(lián)HA 在3 402cm-1處 的―OH 伸 縮 振 動(dòng) 峰 和1 407、1 618 cm-1處羧酸鹽的強(qiáng)特征吸收峰消失，意味著羧酸官能團(tuán)的消失，即證明了交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生；交聯(lián)樣品在1 610 cm-1處均出現(xiàn)弱吸收峰，說(shuō)明生成了―CO―NHR?？梢?jiàn)，使用ADH 對(duì)HA 進(jìn)行交聯(lián)后，HA 中的羥基和羧酸的羰基吸收峰消失，取而代之的是酰胺吸收峰，表明ADH 的氨基與HA 的羧基生成了酰胺，成功實(shí)現(xiàn)了HA 的交聯(lián)；隨著ADH 和EDCI 用量的增加，薄膜中酰胺吸收峰逐漸變強(qiáng)，說(shuō)明 HA 的交聯(lián)程度增加。

2.2 HA 薄膜的表面形貌

圖3顯示了HA薄膜的表面形貌。當(dāng)mHA∶mADH∶mEDCI為10∶1∶1 時(shí)，雖然HA 薄膜表面呈現(xiàn)連續(xù)結(jié)構(gòu)，但表面粗糙不平；隨著ADH 和EDCI 含量的增加，薄膜表面的粗糙程度降低，當(dāng)mHA∶mADH∶mEDCI為4∶1∶1 時(shí)，HA 薄膜表面局部區(qū)域較為光滑，但是表面起伏較大。

圖2 HA 凝膠的紅外譜圖Fig.2 FT-IR spectra of HA gels

圖3 不同配比的HA 薄膜的表面形貌Fig.3 SEM images of HA films with different reagent ratios

為了觀(guān)察HA 凝膠的內(nèi)部交聯(lián)結(jié)構(gòu)，將透析純化后的溶液直接倒入玻璃培養(yǎng)皿，放入-20 ℃冰箱冷凍12 h，取出再凍干操作24 h 后進(jìn)行表面形貌觀(guān)察（圖4）。如圖所示，4 種HA 交聯(lián)凝膠內(nèi)部呈現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)，其形成原因主要在于凍干過(guò)程中凝膠內(nèi)部的水分升華。當(dāng)mHA∶mADH∶mEDCI=10∶1∶1 時(shí)，樣品的孔徑約為850 μm，孔洞較為松散；隨著ADH 和EDCI 用量的增加，凝膠內(nèi)部的孔洞直徑逐漸變小，孔洞結(jié)構(gòu)越來(lái)越緊密；當(dāng)mHA∶mADH∶mEDCI=4∶1∶1 時(shí)，相較于其他凝膠，樣品內(nèi)部孔徑最小，橢圓形長(zhǎng)徑約為350 μm，孔洞結(jié)構(gòu)最為緊密?？梢?jiàn)，ADH 和EDCI 用量的增加提高了HA 的交聯(lián)程度，內(nèi)部孔徑變小，結(jié)構(gòu)趨向緊密，這與HA 交聯(lián)薄膜表面的展示結(jié)果相符。材料內(nèi)部的孔徑結(jié)構(gòu)也會(huì)影響HA 凝膠薄膜的膨脹特性，為了得到尺寸可控的HA 微陣列結(jié)構(gòu)，非常有必要對(duì)薄膜的膨脹特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

圖4 不同配比的HA 凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)的SEM 圖Fig.4 SEM images of internal structures of HA gels with different reagent ratios

綜上所述，隨著ADH 和EDCI 用量的增加，交聯(lián)程度增加，凝膠內(nèi)部孔徑有著逐漸變小的趨勢(shì)，結(jié)構(gòu)更加緊密。由此可以推斷，當(dāng)凝膠溶脹平衡后，材料的膨脹程度不同，孔徑較小的HA 薄膜將會(huì)有較小的體積膨脹系數(shù)，制成的微陣列結(jié)構(gòu)在溶脹平衡后也沒(méi)有明顯的變形和損壞。

2.3 HA 薄膜的降解行為

圖5 示出了HA 薄膜的降解曲線(xiàn)，所有樣品均表現(xiàn)出比較穩(wěn)定的降解速率。隨著ADH 和EDCI 用量的增加，薄膜的交聯(lián)程度增加，材料的孔徑變小，降解速率隨之減慢。14 d 時(shí)，mHA∶mADH∶mEDCI為10∶1∶1 的薄膜幾乎全部降解，mHA∶mADH∶mEDCI為4∶1∶1 的薄膜僅降解了約30%。由此可見(jiàn)，通過(guò)改變HA 薄膜的交聯(lián)程度可以有效地調(diào)控薄膜的降解行為。

2.4 HA 凝膠的生物相容性評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)樣品分為5 組，不同配比的HA 凝膠的生物活性示于圖6。隨著ADH 和EDCI 用量的增加，細(xì)胞活性有所降低。雖然各組樣品的細(xì)胞總數(shù)均低于空白對(duì)照組（Control），但仍具有較好的細(xì)胞活性，HA 凝膠本身未表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性，故均可用于之后的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

圖5 不同配比的HA 薄膜的降解行為Fig.5 Degradation of HA films with different reagent ratios

圖6 不同配比的HA 凝膠的細(xì)胞活性Fig.6 Cell viability of HA gels with different reagent ratios

2.5 表面具有微孔結(jié)構(gòu)的HA 薄膜的制備與評(píng)價(jià)

硅模板的表面設(shè)計(jì):4 種不同尺寸的微孔結(jié)構(gòu)，孔徑（d）分別為10、30、40、100 μm，相應(yīng)微孔結(jié)構(gòu)的間距（w）分別為15、10、40、20 μm，深度均為20 μm。HA 薄膜表面形貌如圖7 所示。HA 薄膜表面具有與硅片母板表面相同的微孔結(jié)構(gòu)，但由于模板的復(fù)制操作誤差和材料特性，最后制作完成得到的HA 薄膜表面結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生變化。由于在制樣過(guò)程中，薄膜表面微結(jié)構(gòu)并非肉眼可見(jiàn)，截面脆斷時(shí)無(wú)法保證斷裂面全部為凹槽直徑部位，所以斷面圖只用來(lái)觀(guān)測(cè)凹槽深度，并不用來(lái)測(cè)量直徑及凹槽間距。

以圖7（d）圖案為例，比較ADH-HA 干膜表面與硅設(shè)計(jì)模板、PDMS 模板的微孔結(jié)構(gòu)差異。硅設(shè)計(jì)模板的孔徑為100 μm、間距為20 μm、深度為20 μm，復(fù)制后PDMS 的間距略有減?。?5 μm），孔徑和深度基本維持不變（參見(jiàn)圖8）。HA 干膜的圓柱凹槽直徑和凹槽之間的間距與硅片母板沒(méi)有顯著差異，但凹槽深度僅為5 μm。這是因?yàn)镠A 交聯(lián)溶液具有較大的黏度，用等離子體對(duì)PDMS 表面進(jìn)行處理，盡管HA 溶液完全浸入PDMS 表面微結(jié)構(gòu)當(dāng)中，制得的HA 薄膜失水凍干后用于SEM 觀(guān)察，凍干制樣過(guò)程對(duì)其結(jié)構(gòu)有重要的影響，尤其是厚度方向，因此，HA 干膜的凹槽深度僅為5 μm 左右。

HA 干膜溶脹后，不同交聯(lián)程度的HA 薄膜的表觀(guān)形貌和溶脹系數(shù)如圖9 所示，所用的PDMS 子板圖案為孔徑10 μm、間距15 μm。如圖9（a）所示，HA 干膜的孔徑約為10 μm，隨著ADH 與EDCI 含量的減少，溶脹后微孔的直徑逐漸增大，S4、S3、S2 的孔徑分別為32、40、50 μm，S1 甚至變形到在顯微鏡下幾乎觀(guān)測(cè)不到微孔結(jié)構(gòu)。圖9（b）中的相對(duì)直徑比更為直觀(guān)地證實(shí)了交聯(lián)劑含量對(duì)HA 薄膜溶脹特性的影響規(guī)律:交聯(lián)劑含量越少，交聯(lián)程度越小，微孔的變形越大，HA 凝膠的膨脹系數(shù)越大。為了構(gòu)建變形小的微米圖案，選用S4 用于不同微孔結(jié)構(gòu)的制備。

圖7 HA 薄膜表面的不同尺寸微孔結(jié)構(gòu)的SEM 圖:（a）孔徑30 μm、間距10 μm，（b）孔徑40 μm、間距40 μm，（c）孔徑10 μm、間距15 μm，（d）孔徑100 μm、間距20 μm，（e）c 圖案的截面圖，（f）d 圖案的斷面圖Fig.7 SEM images of microwells structure on HA films with different dimensions: （a） d=30 μm、w=10 μm, （b） d=40 μm、w=40 μm,（c） d=10 μm、w=15 μm, （d） d=100 μm、w=20 μm, （e） & （f） are section structures of （c） & （d）

圖8 PDMS 微結(jié)構(gòu)的SEM 圖片F(xiàn)ig.8 SEM images of PDMS microstructures

2.6 HA 薄膜表面的微孔結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞增殖的影響

為了研究表面微結(jié)構(gòu)尺寸和圖案對(duì)成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響，選取了尺寸不同、圖案密度不同的4組樣品（樣品 A: 孔徑96 μm、間距32 μm；樣品 B: 孔徑128 μm、間距128 μm；樣品 C: 孔徑32 μm、間距48 μm；樣品 D: 孔徑320 μm、間距64 μm）進(jìn)行研究，以未圖案化的HA 平膜（Flat）作為參比樣品，選用rBMSC 為細(xì)胞模型，通過(guò)MTT 法對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行了測(cè)定（圖10）。

MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組微結(jié)構(gòu)材料表面的細(xì)胞總數(shù)均不低于對(duì)照組。與未圖案化的HA 薄膜表面相比，隨著凹槽直徑的減小，細(xì)胞增殖能力呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。小尺寸HA 薄膜（樣品 C）表面細(xì)胞活性最大，說(shuō)明小尺度的凹槽結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞增殖有著顯著的促進(jìn)作用。令人意外的是，具有較大微米尺寸的樣品 B 相比于樣品A，也有著較好地促進(jìn)細(xì)胞增殖能力，這可能與rBMSCs細(xì)胞鋪展后的直徑有關(guān)（一般為120 μm 左右），與樣品B 的微圖案直徑相近。

2.7 ADH-HA 微結(jié)構(gòu)表面的骨誘導(dǎo)性堿性磷酸酶（ALP）活性比較

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定rBMSC 在一系列不同微結(jié)構(gòu)ADH-HA 薄膜上的ALP 活性，以評(píng)價(jià)微結(jié)構(gòu)對(duì)成骨誘導(dǎo)能力的影響。

圖9 HA 薄膜在PBS 溶液中（a）溶脹結(jié)構(gòu)觀(guān)察和（b）溶脹系數(shù)Fig.9 Swelling properties of HA films with well-defined microstructure （a） observed by microscopy and （b） swelling coefficient

如圖11 所示，使用總蛋白量進(jìn)行均一化后，不同天數(shù)各組薄膜上的細(xì)胞ALP 活性趨勢(shì)大致相近。與未圖案化的 HA 薄膜相比，隨著圓形凹槽直徑的減小，細(xì)胞ALP 活性水平逐漸上升。rBMSCs 在小微米結(jié)構(gòu)（d=32 μm）ADH-HA 薄膜上有著更高的成骨ALP 活性；其他3 組微米結(jié)構(gòu)表面的rBMSCs 的成骨活性略有提高。

圖10 微陣列結(jié)構(gòu)對(duì)rBMSCs 細(xì)胞活性的影響:（A）孔徑96 μm、間距32 μm；（B）孔徑128 μm、間距128 μm；（C）孔 徑32 μm、間 距48 μm；（D）孔 徑320 μm、間 距64 μmFig.10 Effect of cell viability of rBMSCs on the microstructures with different dimensions: （A） d=96 μm、w=32 μm; （B）d=128 μm、w=128 μm; （C） d=32 μm、w=48 μm; （D）d=320 μm、w=64 μm

圖11 微陣列結(jié)構(gòu)對(duì)rBMSCs 的ALP 活性影響:（A）孔徑96 μm、間距32 μm；（B）孔徑128 μm、間距128 μm；（C）孔徑32 μm、間距48 μm；（D）孔徑320 μm、間距64 μmFig.11 Effect of ALP activities of rBMSCs cultured on different microstructure systems: （A） d=96 μm、w=32 μm; （B）d=128 μm、w=128 μm; （C） d=32 μm、w=48 μm; （D）d=320 μm、w=64 μm

3 結(jié) 論

（1）選用可降解高分子HA 作為基底材料，采用交聯(lián)劑ADH 和EDCI 成功地交聯(lián)成膜。

（2）利用PDMS 軟刻膠技術(shù)和溶劑揮發(fā)法制備了表面具有微陣列結(jié)構(gòu)的HA 凝膠薄膜，微陣列結(jié)構(gòu)完整、均勻，微米結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)、可控。

（3）與平滑的HA 薄膜相比，尺寸較大的微米圖案對(duì)細(xì)胞的增殖沒(méi)有顯著影響，而尺寸較小的微米結(jié)構(gòu)（d=32 μm）可以明顯促進(jìn)rBMSCs 的增殖。

（4）與其他尺寸圖案相比，rBMSCs 在小微米結(jié)構(gòu)（d=32 μm）ADH-HA 薄膜上具有更高的成骨ALP 活性。

（5）材料的仿生特征和優(yōu)異的理化性質(zhì)在刺激細(xì)胞行為和引導(dǎo)組織再生方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，然而，表面微結(jié)構(gòu)形貌引導(dǎo)的骨間充質(zhì)干細(xì)胞分化的潛在機(jī)制仍不夠明確，材料特性/微陣列結(jié)構(gòu)與細(xì)胞生物學(xué)的關(guān)系尚需進(jìn)一步探索。